正交試驗法比較女貞子中齊墩果酸與特女貞苷的乙醇提取工藝

郭宇潔， 任 燁， 葛爭艷， 孟 碩， 金 龍， 李雪麗， 劉建勛

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗中心，北京 100091)

女貞子系木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實，具有滋補(bǔ)肝腎和明目烏發(fā)的功效［1］。主要成分有三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇類和黃酮類等成分［2-5］。女貞子系降糖消脂片的君藥，針對女貞子的乙醇提取工藝進(jìn)行了重點(diǎn)研究。2005版《中國藥典》女貞子以齊墩果酸為質(zhì)量控制指標(biāo)［6］，2010版《中國藥典》女貞子以特女貞苷為質(zhì)量控制指標(biāo)［1］。為更好地提取出女貞子的有效成分，本實驗既以齊墩果酸為指標(biāo)成分，又以特女貞苷為指標(biāo)成分，以正交試驗法進(jìn)行女貞子的乙醇提取工藝研究，所篩選的提取工藝兼顧了兩種成分的提取，并對比兩版藥典不同質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對女貞子醇提工藝的影響。

1 儀器與試劑

AglientHP1100高效液相色譜儀 (美國);BRANSON超聲清洗器 (上海必能信超聲有限公司);METTLER AE240電子天平 (梅特勒－托利多儀器有限公司)。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110709-200304);特女貞苷對照品 (中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，編號為090528);女貞子藥材［河北神農(nóng) (北京)藥業(yè)有限公司，批號050428］;乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 齊墩果酸的測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含齊墩果酸0.20 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取女貞子提取物0.4 g，精密稱定，加入甲醇20 mL，加熱回流45 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器和殘渣，洗液轉(zhuǎn)移至同一量瓶中，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 齊墩果酸色譜條件［7-11］島津 Shim-pack CLC-ODS色譜柱 (6.0 mm×150 mm，5 μm);甲醇－0.05%磷酸水 (90∶10)為流動相;柱溫為2℃;檢測波長為215 nm。理論塔板數(shù)按齊墩果酸計算應(yīng)不低于3 000。對照品進(jìn)樣量、供試品進(jìn)樣量均 15 μL。

2.1.4 齊墩果酸線性關(guān)系考察 精密稱取齊墩果酸4.95 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，配制成每1 mL甲醇含0.495 mg的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣體積分別為2、4、6、8、10、16、18 μL，注入高效液相儀，測定峰面積，以齊墩果酸的進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo) (X)、峰面積為縱坐標(biāo) (Y)作圖，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=797.432 382 4x+5.787 446 678，r=1.000 0(n=7)。說明齊墩果酸在0.99～8.91 μg之間線性關(guān)系良好。

2.1.5 齊墩果酸精密度試驗 將供試品溶液注入高效液相儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算齊墩果酸的RSD為1.21%，說明儀器的精密度良好。

2.1.6 齊墩果酸回收率試驗 精密稱取已知齊墩果酸質(zhì)量濃度的樣品適量共6份，置20 mL量瓶中，分別精密加入相當(dāng)于已知對照品量的50%、100%的齊墩果酸對照品，甲醇溶解定容，其余按供試品溶液制備方法進(jìn)行測定，齊墩果酸的平均回收率為99.71%，RSD為1.05%。

2.2 特女貞苷的測定

2.2.1 特女貞苷對照品溶液制備 精密稱取特女貞苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含特女貞苷0.10 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取女貞子提取物0.15 g，精密稱定，加入甲醇20 mL，加熱回流45 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器和殘渣，洗液轉(zhuǎn)移至同一量瓶中，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 特女貞苷色譜條件［12-16］Waters Symmetry C18色譜柱 (3.9 mm×150 mm，5 μm);乙腈－水(17∶83)為流動相;檢測波長為224 nm。柱溫為室溫。理論塔板數(shù)按特女貞苷計算應(yīng)不低于4 000。對照品進(jìn)樣量、供試品進(jìn)樣量均15 μL。

2.2.4 特女貞苷線性關(guān)系 精密稱取特女貞苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入甲醇制成每1 mL甲醇含0.089 6 mg的特女貞苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣體積分別為5、10、15、20、25、30、35 μL，注入高效液相儀，測定峰面積，以特女貞苷的進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo) (X)、峰面積為縱坐標(biāo) (Y)作圖，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=1 326 951.834 17x+16 219.677 936，r=0.999 9(n=8)。特女貞苷在0.179 2～3.316 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 將供試品溶液，注入高效液相儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，特女貞苷的RSD為0.35%，儀器精密度良好。

2.2.6 回收率試驗 精密稱取已知特女貞苷質(zhì)量濃度的樣品適量，置25 mL量瓶中，分別精密加入相當(dāng)于已知對照品量的100%的特女貞苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入甲醇溶解定容，其余按供試品溶液制備方法進(jìn)行測定，特女貞苷平均回收率為103.29%，RSD為1.25%。

2.3 女貞子乙醇提取工藝

2.3.1 以齊墩果酸為指標(biāo)的醇提工藝 準(zhǔn)確稱取破碎過的女貞子藥材20 g，共9份，選定醇提濃度、醇提倍數(shù)和醇提次數(shù)三個因素作為正交試驗的考察因素，每個因素各取三個水平，提取時間為2 h。采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗。因素水平表見表1。樣品減壓干燥后進(jìn)行以HPLC法測定齊墩果酸，其正交結(jié)果見表2，對表2的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理后，其方差分析見表3。

表1 因素水平 (2005年版《中國藥典》齊墩果酸)Tab.1 Fators and levels(Oleanolic Acid of Chinese Pharmacopoeia 2005)

以齊墩果酸為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析 (見表2)和方差分析 (見表3)，影響因素順序為A＞C＞B，即醇提濃度＞醇提次數(shù)＞加醇倍數(shù);最佳工藝為A2B3C3，即以齊墩果酸為考察指標(biāo)，最佳提取工藝為A2B3C3，即以6倍量75%乙醇提取三次，每次2 h。方差分析結(jié)果表明3個因素對齊墩果酸的提取效果均無顯著性影響。

表2 正交試驗結(jié)果 (2005年版《中國藥典》齊墩果酸)Tab.2 Results of orthogonal test(Oleanolic Acid of Chinese Pharmacopoeia 2005)

表3 方差分析 (2005年版《中國藥典》齊墩果酸)Tab.3 Variance analysis(Oleanolic Acid of Chinese Pharmacopoeia 2005)

2.3.2 以特女貞苷為指標(biāo)的醇提工藝 準(zhǔn)確稱取破碎過的女貞子藥材20 g，共9份，選定醇提濃度、醇提倍數(shù)和醇提次數(shù)三個因素作為正交試驗的考察因素，每個因素各取三個水平，提取時間為2 h。采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗。因素水平表見表4。樣品減壓干燥后進(jìn)行以HPLC法測定特女貞苷，其正交結(jié)果見表5，對表5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理后，其方差分析見表6。

表4 因素水平 (2005年版《中國藥典》特女貞苷)Tab.4 Fators and levels(Specnuezhenide of Chinese Pharmacopoeia 2010)

以特女貞苷為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析 (見表4)和方差分析 (見表5)，影響因素順序為C＞B＞A，即醇提次數(shù)＞加醇倍數(shù)＞醇提濃度;方差分析結(jié)果表明C因素對特女貞苷的提取效果有顯著性影響。即:以特女貞苷為考察指標(biāo)，最佳提取工藝為A3B3C3，即以6倍量75%乙醇提取3次，每次2 h。

2.3.3 女貞子提取工藝驗證試驗 準(zhǔn)確稱取破碎過的女貞子藥材20 g共3份，按最佳提取工藝條件提取，進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果見表7。

表5 正交試驗結(jié)果 (2010版《中國藥典》特女貞苷)Tab.5 Results of orthogonal test(Specnuezhenide of Chinese Pharmacopoeia 2010)

表6 方差分析 (2010版《中國藥典》特女貞苷)Tab.6 Variance analysis(Specnuezhenide of Chinese Pharmacopoeia 2010)

表7 驗證試驗結(jié)果Tab.7 Results of verification test

由以上實驗可知，女貞子以齊墩果酸為考察指標(biāo) (2005年版《中國藥典》)和以特女貞苷為考察指標(biāo) (2010年版《中國藥典》)進(jìn)行醇提工藝優(yōu)選時，最佳工藝均為女貞子以6倍量75%乙醇提取3次，每次2 h。驗證試驗表明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。此提取條件可以兼顧到女貞子中齊墩果酸和特女貞苷成分的提取，更有效保證女貞子的提取效果。

3 討論

齊墩果酸為2005版《中國藥典》中女貞子的質(zhì)量控制指標(biāo)，在建立齊墩果酸HPLC法測定方法的同時，也必須同時建立HPLC測定熊果酸的方法，因為齊墩果酸和熊果酸是同時存在于女貞子藥材中的兩個同分異構(gòu)體，兩者理化性質(zhì)非常接近。本研究通過試驗，建立了HPLC法同時測定齊墩果酸和熊果酸的方法。

齊墩果酸進(jìn)行HPLC法測定時，柱溫的選擇很關(guān)鍵。曾在柱溫25℃、17～18℃、5℃和2℃等條件下進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為2℃時齊墩果酸和熊果酸的分離度大于1.5，符合要求，故選擇柱溫2℃，解決了HPLC法同時測定齊墩果酸和熊果酸的問題。見圖1～2。

在女貞子的工藝研究中，齊墩果酸、熊果酸和特女貞苷均為女貞子的有效成分，前者優(yōu)選的醇提條件和后者優(yōu)選的醇提條件正好一致，相一致的提取工藝僅適用于女貞子，不同的中藥需要不同對待和研究。中藥材工藝考察時應(yīng)該以兩種成分或者多種成分的綜合提取效果進(jìn)行評價，必要的時候結(jié)合藥理藥效結(jié)學(xué)評價，才能充分保證提取工藝的可行性和藥物的藥效。

圖1 齊墩果酸和女貞子藥材的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of oleanolic acid and Ligustri Lucidi Fructus.

圖2 特女貞苷對照品 (A)、女貞子藥材樣品 (B)液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of specnuezhenide reference substance(A)and sample of Ligrustri lucidi Fructus(B)

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