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    四種藥用真菌體外抗腫瘤活性的初步研究

    2013-08-27 06:59:46
    中國民族民間醫(yī)藥 2013年17期
    關鍵詞:孔菌石油醚藥用

    張 睿

    遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心,貴州 遵義 563099

    藥用真菌是一類具有藥用價值的真菌,即在菌絲體、子實體、菌核或孢子中能產(chǎn)生諸如氨基酸、蛋白質多糖、苷類、生物堿、黃酮類及萜類等多種物質,對疾病有預防、抑制或治療作用[1]。我國地域遼闊,自然條件和生態(tài)環(huán)境十分復雜,造成了藥用真菌種類的多樣性,據(jù)不完全統(tǒng)計,我國的藥用真菌大約500種,其中大型藥用真菌約有300多種,但已開發(fā)的大型藥用真菌只有20至30種[2]。藥理研究也集中在降血脂、抗腫瘤、調節(jié)機體免疫力、調節(jié)新陳代謝等方面[3],在諸多活性中,抗腫瘤活性最引人關注,且抗腫瘤活性成分主要為多糖、萜類物質、蛋白及生物堿等[4]。研究以斑褐孔菌、裂蹄木層孔菌、苦白蹄、木蹄層孔菌為研究對象,對其石油醚提取物的體外抗腫瘤活性進行初步研究,以期為這四種大型真菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    斑褐孔菌 (Fuscoporia punctata)、裂蹄木層孔菌(Phellinus rimosus)、苦白蹄 (Fomitopsis officinalis)、木蹄層孔菌 (Pyropolyporus fomentarius),采自吉林省敦化市。人肺腺癌細胞A-549由遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心提供。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清,美國Gibco公司;胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、Tris堿,美國Amresco公司;磺酰羅丹明、DMSO,美國Sigma公司;其余試劑均為分析純。

    R-210型旋轉蒸發(fā)儀,瑞士Buchi公司;3131型CO2培養(yǎng)箱、臺式離心機、全波長酶標儀,美國Thermo公司;單人超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;Ti-S倒置相差顯微鏡,日本Nikon公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 石油醚提取物的制備 真菌子實體60℃烘干、粉碎、稱取粉末100g,加1L石油醚60℃連續(xù)回流提取兩次,每次3h。合并提取液,旋轉蒸發(fā)除去溶劑得浸膏,60℃烘干后得樣品斑褐孔菌石油醚提取物 (PEFP)、裂蹄木層孔菌石油醚提取物 (PEPR)、苦白蹄石油醚提取物 (PEFO)、木蹄層孔菌石油醚提取物 (PEPF)。精密稱取樣品10mg,用100μL DMSO溶解,臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

    1.2.2 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌細胞A-549用RPMI-1640完全培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

    1.2.3 SRB法測定提取物對腫瘤細胞增殖的影響 參照文獻[5]方法略有改動。取對數(shù)生長期A-549細胞,消化后調整細胞濃度為10000個/mL,每種細胞平行接種兩塊96孔板,分別為對照板 (T0)和實驗板 (T)。每孔加入細胞懸液100 μL,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h后,對照板細胞用預冷的50%三氯乙酸 (TCA)固定,待測;同時實驗板中加入100μL的提取物 (調節(jié)終濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL),陰性對照孔 (C)加入含有相同濃度 DMSO的培養(yǎng)基。每組設5個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出培養(yǎng)板,50%的TCA 4℃固定1h,去離子水洗板,自然干燥,SRB染色,10min后用0.1%醋酸洗板,自然干燥,200μL Tris液溶解,530nm處測吸光度值 (OD值),按下列公式計算生長抑制率。并采用寇氏改良法計算各提取物對A-549的半數(shù)抑制濃度 (IC50)。

    寇氏改良法計算公式:lgIC50=Xm-I(P- (3-Pm-Pn)/4)(Xm:lg最大劑量;I:lg(最大劑量/相臨劑量);P:陽性反應率之和;Pm:最大陽性反應率;Pn:最小陽性反應率)

    2 結果

    2.1 對肺癌A-549細胞增殖的影響PEFP、PEFO、PEPR、PEPF作用于人肺腺癌細胞A-549細胞48h以后,對細胞增殖的抑制作用見表1、2。PEFP、PEFO、PEPF對A-549均具有抑制作用,且抑制率隨藥物濃度的增大而增大,呈劑量依賴關系。其中,PEFP對A-549的抑制作用最強,而PEPR對A-549的增殖沒有影響。寇氏改良法計算PEFP、PEFO 對 A -549的 IC50,分別為 55.99μg/mL、67.55μg/mL。

    表1 PEFP、PEPR對A-549細胞增殖的影響(±S,n=5)

    表1 PEFP、PEPR對A-549細胞增殖的影響(±S,n=5)

    注:“-”表示缺省;“*”表示與陰性對照組比較,P<0.05。下同。

    組別 藥物濃度(μg/mL)PEFP PEPR OD值 抑制率 (%) OD值 抑制率 (%)對照組 -0.24±0.01 - 0.24±0.01 -陰性對照組 - 1.48±0.03 - 1.53±0.05 -實驗組 10 1.14±0.07* 27.42 1.26±0.02* 20.93 20 1.06±0.05* 33.87 1.23±0.06* 23.26 40 0.94±0.04* 43.55 1.19±0.01* 26.36 60 0.71±0.05* 62.10 1.09±0.06* 34.11 80 0.62±0.02* 69.35 0.81±0.06* 55.81 100 0.57±0.03* 73.39 0.67±0.04*66.67

    表2 PEPR、PEPF對A-549細胞增殖的影響 (±S,n=5)

    表2 PEPR、PEPF對A-549細胞增殖的影響 (±S,n=5)

    組別 藥物濃度(μg/mL)PEFP PEPR OD值 抑制率 (%) OD值 抑制率 (%)對照組 -0.24±0.01 - 0.24±0.01 -陰性對照組 - 1.48±0.03 - 1.53±0.05 -實驗組 10 1.14±0.07* 27.42 1.26±0.02* 20.93 20 1.06±0.05* 33.87 1.23±0.06* 23.26 40 0.94±0.04* 43.55 1.19±0.01* 26.36 60 0.71±0.05* 62.10 1.09±0.06* 34.11 80 0.62±0.02* 69.35 0.81±0.06* 55.81 100 0.57±0.03* 73.39 0.67±0.04*66.67

    2.2 斑褐孔菌對肺癌A-549細胞形態(tài)的影響 由圖1所知,陰性對照組的細胞正常生長,細胞膜完整,形態(tài)規(guī)則,細胞貼壁緊密;細胞經(jīng)IC50濃度的PEFP作用48h后,細胞數(shù)量明顯減少,細胞體積變小,大部分細胞凋亡或壞死,細胞膜破裂,懸浮在培養(yǎng)基中,已經(jīng)不能見到完整的細胞。

    圖1 斑褐孔菌石油醚提取物對A-549細胞形態(tài)的影響 (×100)

    3 結論與討論

    通過斑褐層孔菌、裂蹄木層孔菌、苦白蹄、木蹄層孔菌四種大型多孔類真菌石油醚提取物對人肺癌細胞A-549細胞增殖的實驗結果表明,斑褐層孔菌、苦白蹄石油醚提取物對A-549具有較好的抑制效果;木蹄層孔菌的抑制效果不明顯;裂蹄層孔菌對A-549沒有抑制作用。在后期的研究工作中將會針對活性較好的斑褐層孔菌、苦白蹄的石油醚提取物進行進一步深入研究,希望能發(fā)現(xiàn)更有價值的活性組分或單體化合物。

    實驗采用SRB檢測細胞增殖活性,該法是美國國立癌癥研究所 (National Cancer Institute,NCI)篩選抗癌藥物的一種新方法,能克服MTT法成色反應的時間依賴性,測定結果幾乎不隨時間而變,不失為一種篩選抗癌藥物的好方法。結合藥理篩選廣泛開展抗腫瘤真菌的基礎研究,尋找抗腫瘤活性先導化合物一方面可促進我國豐富真菌資源的開發(fā)和利用,另一方面可為抗腫瘤新藥的研發(fā)提供基礎。

    [1]徐錦堂.中國藥用真菌學[M].北京:北京醫(yī)科大學、中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1997.3.

    [2]殷培峰,浦冠勤.中國藥用真菌研究進展[J].滁州學院學報,2008,10(6):58-60.

    [3]王謙,賈震.食藥用真菌的藥理作用研究進展[J].醫(yī)藥研究與教育,2010,27(5):67-69.

    [4]閆黎,許立,李霞.真菌中抗腫瘤活性成分的作用及機制研究進展[J].武警醫(yī)學院學報,2009,18(8):740-742.

    [5]Vanicha Vinchai,Kanyawin Kirtikara.Sulforhodamine Bcolorimetric assay for cytotoxicity screening[J].Nature Protocols,2006,1(3):1112-1116.

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