萊菔子水溶性生物堿對(duì)載脂蛋白E基因缺陷小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶、核因子－кB的影響

張國(guó)俠 蓋國(guó)忠

動(dòng)脈粥樣硬化的中醫(yī)學(xué)病因可歸結(jié)為痰濁、血瘀范疇。其中尤以痰濁型常見。西醫(yī)在治療本病的時(shí)候多用他汀類藥物，雖療效確切但是對(duì)肝腎功能影響較大。中藥復(fù)方制劑常常因服用不方便而導(dǎo)致患者依從性差，因此，探尋單味中藥治療本病，發(fā)揮簡(jiǎn)、效、便、廉的優(yōu)勢(shì)，有較高的社會(huì)價(jià)值。本研究提取了萊菔子有效成分水溶性生物堿，并以載脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠為研究對(duì)象，從血管內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制方面著手，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 藥品

萊菔子水溶性生物堿。生萊菔子采用水提醇沉方法提取而成。由吉林省中醫(yī)中藥研究院新藥中心制備(實(shí)驗(yàn)專用)。

1.2 動(dòng)物

雄性ApoE-/-小鼠30只，雄性C57BL/6J小鼠6只，13周齡，體重(22±2)g，清潔級(jí)，北京維通利華公司提供。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

電子記重秤AWH(SI)－2.5 kg:國(guó)產(chǎn);BD/BC－518 －20℃冰箱:國(guó)產(chǎn);4℃ 冰箱:國(guó)產(chǎn);Q/IFGM018－2000低溫高速離心機(jī):德國(guó);HH·W21·600電熱恒溫水浴箱;小型臺(tái)式離心機(jī)，上海醫(yī)療器械廠;PERLONG;pus－2018半自動(dòng)生化分析儀:北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.4 基礎(chǔ)飼料

玉米粉26.0%，面粉29.0%，豆粕28.0%，磷酸氫鈣1.4%，石粉1.6%，魚粉5.0%，骨粉5.0%，鹽1.0%，多種維生素1.5%，多種微量元素1.5%。

肥甘飼料:參見文獻(xiàn)［1］。

1.5 分組及給藥

將ApoE-/-小鼠(高脂飲食)隨機(jī)分為5組，每組6只。C57BL/6J(同種同系):每日灌服飲用水;萊菔子水溶性生物堿高劑量組:90 mg/(kg·d)，溶于1 ml蒸餾水，灌胃。中劑量組:60 mg/(kg·d)，溶于1 ml蒸餾水，灌胃。低劑量組:30 mg/(kg·d)，溶于1 ml蒸餾水，灌胃。血脂康組:0.2 g/(kg·d)，溶于1 ml蒸餾水，灌胃。模型組給以等體積蒸餾水灌胃。給藥時(shí)間為8周。

1.6 標(biāo)本

每組取6只小鼠，小鼠經(jīng)摘除眼球采血后，立即拉椎處死，快速切取主動(dòng)脈弓組織1 cm，將其迅速放置4%多聚甲醛固定液中固定。每只小鼠的主動(dòng)脈弓切片在400倍鏡下選取3個(gè)不同的視野。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示，運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行計(jì)算，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萊菔子水溶性生物堿各給藥組均能抑制小鼠胸主動(dòng)脈核因子-кB(nuclear factorкB，NF-кB)蛋白表達(dá)，并且隨著劑量的增加，抑制的作用增強(qiáng);均能提高小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothlial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白表達(dá)，并且隨著劑量的增加，作用增強(qiáng)。并且萊菔子水溶性生物堿高劑量組的作用與血脂康組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3 討論

1999年Ross在總結(jié)“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說［2-3］”的基礎(chǔ)上提出了炎癥學(xué)說。其提出動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥反應(yīng)性疾病，因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化有同慢性炎癥反應(yīng)一樣的基本特征，即:變質(zhì)、滲出、增生［4］。

目前中藥研究抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究主要集中在降血脂、抗過氧化、血管內(nèi)皮保護(hù)、抑制平滑肌細(xì)胞增殖遷移等方面。經(jīng)過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)中藥抗動(dòng)脈粥樣硬化研究從炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子表達(dá)方面入手的較少。此外，進(jìn)行試驗(yàn)所選藥物大多為復(fù)方且以個(gè)人經(jīng)驗(yàn)方為主，對(duì)于單味藥、單體有效成分的研究較少。

表1 各組治療8周后胸主動(dòng)脈壁eNOS、NF-кB蛋白表達(dá)比較

表1 各組治療8周后胸主動(dòng)脈壁eNOS、NF-кB蛋白表達(dá)比較

注:與模型組比較，a P﹤0.01;與C57BL/6J比較，b P﹤0.01，c P﹤0.05;與血脂康組比較，d P﹤0.01，e P﹤0.05;n代表視野。

組別 eNOS NF－кB 140.67±5.65 46.99±4.33 C57BL/6J 102.33±5.01a 132.17±9.22a高劑量組 110.83±5.23ac 95.99±2.27ab中劑量組 119.33±4.59abe 86.21±4.28abd低劑量組 128.83±3.66abd 75.62±1.07abd血脂康組 110.5±5.58ac 98.39±5.86模型組ab

綜上，課題組在對(duì)萊菔子單味藥有效成分提取的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，從保護(hù)血管內(nèi)皮，抗炎的機(jī)制方面進(jìn)行研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明萊菔子水溶性生物堿能夠提高ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)，抑制核因子-кB的表達(dá)。由于在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的進(jìn)程中，NF-кB 是多種炎癥因子的啟動(dòng)因子，在AS的發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而NO有抗炎作用。已有研究證實(shí)，由于NO能夠作用于NF-кB的抑制因子，減少各種致炎癥因素刺激內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)到抗AS的作用［5］?？梢姡R菔子水溶性生物堿通過增加NO的合成，發(fā)揮NO的生理作用，進(jìn)而達(dá)到抗AS的目的。由于，本實(shí)驗(yàn)選用的動(dòng)物模型為基因缺陷小鼠，課題組發(fā)現(xiàn)中醫(yī)學(xué)先天稟賦因素在AS的發(fā)病中有重大作用，并且，萊菔子水溶性生物堿具有干預(yù)作用。

［1］Prediman K，Nilsson J，Kaul S，et al.Effects of recombinant Apolipoprotein A-IMilano on aortic atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Circulation，1998，97:780-785.

［2］Ross R，Glomset J A.The pathophysiology of atherosclerosis［J］.N Engl J Med，1976，295(8):420-425.

［3］de Boer OJ，van der Wal AC，Becker AE.Atherosclerosis，inflammation，and infection［J］.Pathol，2000，190(3):237-243.

［4］Ross R.Atherosclerosis an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340(2):115-126.

［5］Fleming I，Bauersachs J，Busse R.Parac nine functions of the cononary vascular endothelium［J］.Mol Cell Biochem，1996，157:137.