灰離褶傘菌中活性物質(zhì)體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究

李春豐,姜 蓓,田 寅

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

食用菌是真菌中的可以食用或藥用菇體種類的總稱,具有肉質(zhì)子實(shí)體。食用菌中含有生物活性物質(zhì)對(duì)維護(hù)人體健康有重要的利用價(jià)值。以食用菌為原料生產(chǎn)加工的保健食品和藥品用于醫(yī)療臨床及投入保健品市場(chǎng)。因此,食用菌作為一種綠色食品受到各國(guó)人民的重視。食用菌不僅味美,而且營(yíng)養(yǎng)豐富,常被人們稱作健康食品,還具藥用保健價(jià)值;降低血液中的膽固醇、治療高血壓的作用,還發(fā)現(xiàn)含有增強(qiáng)人體抗癌能力的物質(zhì)?；译x褶傘。隸屬于真菌門(mén)、同擔(dān)子菌亞綱、傘菌目、白蘑科、離褶傘屬,別名:塊根蘑,俗稱一窩雞 ,我國(guó)一般多產(chǎn)于黑龍江、吉林、云南、西藏一帶?；译x褶傘一般在夏末到秋季間生長(zhǎng),灰離褶傘喜好群生或者叢生,此種菌肉肥厚,味道鮮美,屬優(yōu)良食菌,可人工栽培?；译x褶傘是一種具有食藥用價(jià)值的真菌,含有豐富的蛋白質(zhì)、人體必需氨基酸、糖類、多種維生素營(yíng)養(yǎng)素等有效成分,可治消化不良、胃腸脹滿等?；译x褶傘具有較好的民間應(yīng)用基礎(chǔ),臨床治療腫瘤也有較滿意的療效。具抗癌作用。為了探究灰離褶傘活性物質(zhì)的抗腫瘤活性,本文在實(shí)驗(yàn)室自制灰離褶傘活性物質(zhì)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步進(jìn)行離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析得到活性物質(zhì),并對(duì)兩種活性物質(zhì)進(jìn)行了體外抑癌實(shí)驗(yàn),為灰離褶傘的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

灰離褶傘活性物質(zhì),由本實(shí)驗(yàn)室制備。細(xì)胞株供試瘤株為大腸癌 HT29、人胃癌細(xì)胞株 BGC823佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。主要試劑甲醇、乙醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、香草醛顯色劑、無(wú)水乙醇、環(huán)磷酰胺、濃硫酸等。硫酸顯色劑、胰酶與 EDTA消化液、M TT等。主要儀器:高速低溫離心機(jī),薄層層析硅膠板,電子分析天平 、超低溫冰箱、96孔培養(yǎng)板、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 灰離褶傘活性物質(zhì)提取方法

粉碎后的灰離褶傘子實(shí)體,用乙醇浸提濃縮。用乙酸乙酯和水溶解后,反復(fù)萃取,直至有機(jī)相無(wú)色,取有機(jī)相部分濃縮。將硅膠和石油醚混合 ,裝入層析柱 ,石油醚為流動(dòng)相,接樣,直至柱內(nèi)硅膠流實(shí)。有機(jī)相用硅膠拌樣,用石油醚浸潤(rùn),用滴管加到層析柱中。石油醚 /乙酸乙酯梯度洗脫,依次接樣,每瓶約 250mL,然后蒸樣濃縮 ,得70瓶。分別用薄層層析檢板,合并相似的組分。對(duì)各個(gè)組分分別繼續(xù)提純。

1.2.2 處理液的配制

試驗(yàn)前用 RPMI-1640液溶解 ,分別配成 1.5 μg/mL、15 μg/mL、150 μg/mL的溶液 ,無(wú)菌過(guò)濾 ,備用。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)方法

將腫瘤細(xì)胞用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法,HT29和 BGC823細(xì)胞用 RPMI-1640營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng),消化呈單個(gè)細(xì)胞,稀釋、計(jì)數(shù),每2天換液1次,加足營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。按1:2比例傳代,3～4d傳代1次,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 改良 M TT法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期形態(tài)佳的兩種瘤細(xì)胞。用0.25%胰酶和0.02%ETDA(1:1)消化液,消化分散成單個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù),稀釋成 1～5× 104個(gè) /mL,加入 96孔培養(yǎng)板每孔 200μL,置 5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,然后加已稀釋好的灰離褶傘提取物,陰性對(duì)照用相應(yīng)培養(yǎng)液代之,陽(yáng)性對(duì)照用環(huán)磷酰胺,20μL/孔 ,再 繼 續(xù)培養(yǎng) 48h。取 HT29和 BGC823細(xì)胞 采 用M TT法,藥物與細(xì)胞作用48h后,吸去培養(yǎng)液,加入 M TT顯色,用酶標(biāo)儀 (490nm波長(zhǎng))測(cè)出各孔光密度(OD)值。以光密度值(OD)表示細(xì)胞數(shù)量。抑制率%=(對(duì)照組 OD值-給藥組 OD值)/對(duì)照組 OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì) HT29細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

從表1中可以看出,灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì)大腸癌 HT29細(xì)胞的抑制率均隨著多糖濃度的增大而增大。說(shuō)明灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì) HT29細(xì)胞增殖的抑制作用有一定的劑量依賴性?；译x褶傘活性物質(zhì)處理組的 M TT檢測(cè) OD值與陰性對(duì)照組間無(wú)顯著差異外,其余各組的 M TT檢測(cè) OD值均顯著或極顯著低于陰性對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1 灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì) HT29細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì) BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

從表2中可以看出,灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞的抑制率均隨著多糖濃度的增大而增大。說(shuō)明灰離褶傘活性物質(zhì) BGC823細(xì)胞增殖的抑制作用有一定的劑量依賴性。灰離褶傘活性物質(zhì)處理組的 M TT檢測(cè) OD值與陰性對(duì)照組間無(wú)顯著差異外,其余各組的 M TT檢測(cè) OD值均顯著或極顯著低于陰性對(duì)照組。見(jiàn)表2。

表2 灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì) BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

3 討論

本試驗(yàn)用灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞 HT29和BGC823進(jìn)行體外試驗(yàn) ,用 M TT法測(cè)定細(xì)胞的增殖抑制率,表明灰離褶傘活性物質(zhì)對(duì)大腸癌 HT29、人胃癌細(xì)胞株BGC823兩種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用,且其抑制率與濃度呈良好的量效關(guān)系。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行推測(cè),其抗癌的機(jī)制可能是通過(guò)提高機(jī)體免疫功能而間接的影響癌細(xì)胞,抑制細(xì)胞的增殖,為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)白頭翁抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

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