葛根素對(duì)大鼠糖尿病牙周炎的療效及血清 AGEs的影響

朱建華,崔丹丹,申文濱,劉繼光

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué)研究生處,黑龍江佳木斯 154007)

牙周炎(Periodontitis)是牙周支持組織的慢性感染性疾病,由最初牙周軟組織的炎性改變,發(fā)展為結(jié)締組織損傷及骨質(zhì)破壞,是造成我國(guó)成年人失牙的主要原因。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)牙周炎不僅累及牙周組織,而且同樣是導(dǎo)致一些全身性疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因素,嚴(yán)重影響人們的健康。糖尿病作為繼腫瘤、心血管疾病之后的世界第三大非傳染性疾病,同樣威脅著人類(lèi)的健康。已有學(xué)者提出牙周炎是糖尿病的第六并發(fā)癥。目前,許多研究已經(jīng)證實(shí)了糖尿病與牙周炎的雙向關(guān)系[1]。糖尿病患者牙周病發(fā)病率明顯高于無(wú)糖尿病者,并且病變損壞嚴(yán)重、進(jìn)展迅速。因此,糖尿病牙周炎的治療至關(guān)重要。

對(duì)于糖尿病牙周炎的患者的治療目前還沒(méi)有一種安全有效的有針對(duì)性的治療方法,單純治療牙周炎的方法是不可行的,因?yàn)閼?yīng)用抗生素治療對(duì)于糖尿病病人來(lái)說(shuō)副作用太大許多病人都無(wú)法耐受,且抗生素的不合理應(yīng)用影響降糖藥物的有效吸收致使糖尿病患者血糖控制不良,由此導(dǎo)致牙周炎與糖尿病互為影響因素,病情進(jìn)一步惡化。所以尋找一種安全有效的方法解除糖尿病病人患牙周炎的痛苦成為一種函待解決的問(wèn)題。大量臨床實(shí)踐證明:中醫(yī)中藥治療療效確切,毒副作用少 ,費(fèi)用低,且易于被患者接受。因此,尋找一種中藥治療糖尿病牙周炎就具有了十分重要的意義。

葛根素90年代開(kāi)始應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的研究,并取得了一定的成果[2]。大量的實(shí)驗(yàn)證明:葛根素可有效的控制血糖濃度,又可阻止蛋白質(zhì)糖基化的過(guò)程,減少血清 AGEs的形成,下調(diào)其配體 RAGE的過(guò)度表達(dá)[3],且葛根素具有類(lèi)雌激素樣作用,可改善骨質(zhì)代謝。近年來(lái)有學(xué)者研究表明100 μg˙L-1的葛根素在作用48 h后可以顯著刺激成骨細(xì)胞ALP的合成分泌[4]。另一方面,葛根素又引起了體外破骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的顯著變化及骨吸收功能的下降?；诖嘶A(chǔ),本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),觀察中藥葛根素對(duì)糖尿病大鼠牙周炎的療效,并初步探討其機(jī)制,而為臨床治療糖尿病牙周炎提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡健康雄性 SD大鼠50只,體重180～220g(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 )。

主要試劑及藥物:葛根素注射液 (安徽聯(lián)誼藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào) 120205);氨基弧鹽酸鹽 (美國(guó) Sigma公司);四氧嘧啶 (alloxan)(中科瑞泰公司);Commassie改良增強(qiáng)型蛋白質(zhì)定量試劑盒 (武漢博士德生物工程公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及用藥方法

將50只健康雄性 SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組(D組)10只、模型組40只,按200mg/kg劑量腹腔一次性注射10%四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病 ,3d后,選擇空腹血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作為糖尿病模型。1周后,采用0.2mm正畸結(jié)扎絲加絲線,結(jié)扎糖尿病大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙頸部,術(shù)后高糖飲食。4周后,隨機(jī)抽取3只大鼠進(jìn)行組織學(xué)觀察,確認(rèn)牙周炎模型建立。最后成模 30只 ,將成模大鼠隨機(jī)分為 A實(shí)驗(yàn)組 (10只 ),B陽(yáng)性對(duì)照組 (10只),C空白對(duì)照組 (10只 )。A組按100mg/kg˙d腹腔注射葛根素注射液,B組按 100mg/kg˙d經(jīng)口灌注氨基胍水溶液,C組于腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 血糖的檢測(cè)

分別于成模后,用藥第 4,6周上午 9時(shí),測(cè)量大鼠空腹血糖。于大鼠尾靜脈取血,采用拜安捷快速血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)測(cè)定血糖值。

1.2.3 標(biāo)本制備

連續(xù)喂養(yǎng)6周,分別于4、6周時(shí)將大鼠各處死5只后 ,迅速剪取包括上頜骨、牙槽骨、牙及牙周組織在內(nèi)的完整組織塊,去除結(jié)扎絲,4%多聚甲醛固定24h,修整標(biāo)本,僅保留磨牙區(qū)段頜骨及牙周組織,頰舌向拍攝三維 CT片,采集標(biāo)本數(shù)碼照片,并用其系統(tǒng)自帶圖像測(cè)量軟件測(cè)量第一磨牙牙槽嵴頂高度的降低,即釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x,觀察牙槽骨的吸收情況。然后將標(biāo)本用15%的 EDT A4℃脫鈣8周,每三天換一次脫鈣液。脫鈣完成后,脫水,包埋,制作上頜第一磨牙近遠(yuǎn)中向石蠟切片 ,片厚5μm,連續(xù)切片。 HE染色,選擇切到完整的牙冠根組織的切片,觀察牙周組織的改變。

大鼠心臟采血后,制備血清 。取0.2mL血清蒸餾水稀釋至 2mL,參照文獻(xiàn)[5]方法用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng) /發(fā)射波長(zhǎng)分別為354nm/462nm縫寬 10nm)測(cè)定血清 AGEs熒光強(qiáng)度?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定待測(cè)樣品蛋白質(zhì)濃度。樣品中 AGEs的含量以 AU/mg˙蛋白 (AU/mg˙prot)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,數(shù)據(jù)間差異性比較采用單因素方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況,空腹血糖及口腔內(nèi)情況

四氧嘧啶注射 24h后,大鼠即出現(xiàn)多飲,多食,多尿等癥狀。72h后,測(cè)得血糖高于16.7mmol/L,C組保持此值至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。A、B組至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),有所好轉(zhuǎn)。且血糖低于16.7mmol/L與 C組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),見(jiàn)表1。口腔內(nèi)情況,D組大鼠牙齦組織呈粉紅色,無(wú)充血 水腫,無(wú)松動(dòng)等。A、B、C組大鼠在造模四周時(shí),均出現(xiàn)了牙齦紅腫,探診出血,牙齒松動(dòng)。在用藥 4周時(shí),A B組大鼠牙齦紅腫程度及探診出血量較 C組比較明顯減輕。

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空腹血糖比較 (±s,mmol/L)

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空腹血糖比較 (±s,mmol/L)

注:*#與同一時(shí)期對(duì)照組比較,P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后4周 用藥后6周A組 24.29± 3.35* 16.28± 5.65* 12.03± 3.96*B組 21.73± 3.60# 14.15± 3.94# 12.53± 3.93#C組 22.91± 2.70 26.13± 3.12 27.02± 2.40 D組 5.08± 0.23 5.44± 0.47 5.68± 0.46

2.2 大鼠血清 AGEs含量的變化

大鼠血清 AGEs濃度變化在用藥4,6周時(shí) ,A組與 C組,B組與 C組比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),A、B、C組與 D組比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),但是6周時(shí),A組與 B組比較無(wú)明顯差異 (P＞ 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清 AGES含量的比較 (±s,AU/mg.pro)

表2 各組大鼠血清 AGES含量的比較 (±s,AU/mg.pro)

注:*#與同一時(shí)期對(duì)照組比較,P＜0.05。

組別 用藥后4周 用藥后6周A組 83.46± 7.13* 74.33± 9.75*B組 71.00± 8.29# 66.72± 6.34#C組 114.50± 4.70 136.23± 5.47 D組 38.37± 4.02 41.03± 3.34

2.3 大鼠牙槽吸收狀況

當(dāng)用藥4周時(shí),各組大鼠牙槽骨吸收狀況見(jiàn)表3。分別在根分叉及遠(yuǎn)中牙槽嵴頂處吸收較明顯。其牙槽嵴高度的變化值 A組,B組明顯低于 C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),但是仍明顯高于 D組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表3 4周時(shí),各組大鼠牙槽骨高度降低的比較 (±s,mm)

表3 4周時(shí),各組大鼠牙槽骨高度降低的比較 (±s,mm)

組別 用藥后4周A組 1.21± 0.21 B組 1.05± 0.13 C組 1.52± 0.27 D組 0.28± 0.04

2.4 組織學(xué)觀察

光鏡下可見(jiàn),在給藥四周時(shí),健康組牙齦上皮以及牙周膜連續(xù)完整無(wú)破壞,無(wú)炎性滲出。結(jié)合上皮位置正常,牙齦膠原纖維無(wú)變性,無(wú)牙槽骨吸收。糖尿病牙周炎組,牙齦上皮糜爛壞死,呈現(xiàn)不連續(xù)的絮狀物,牙周膜厚薄不一,牙周膠原纖維變性,結(jié)合上皮向根方增殖,形成深牙周袋,且上皮釘突伸長(zhǎng),牙槽骨高度降低,見(jiàn)大量的骨吸收陷窩。葛根素治療組,牙齦上皮較完整炎癥減輕,牙周膜連續(xù),牙周膠原纖維增生,牙槽嵴頂見(jiàn)大量的新生骨基質(zhì)及成骨細(xì)胞。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用傳統(tǒng)的正畸結(jié)扎絲加纏絲線的方法結(jié)扎實(shí)驗(yàn)牙牙頸部 ,此方法絲線不容易脫落,有利于軟垢、菌斑的附著,進(jìn)而造成對(duì)牙齦的機(jī)械損傷,導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)不完整 ,使牙齦易受細(xì)菌侵入,保證了牙周炎模型的可靠、穩(wěn)定[6]。四氧嘧啶腹腔注射是最常用的,安全可靠的糖尿病造模方法。四氧嘧啶是一種β細(xì)胞毒劑,可選擇性地?fù)p傷動(dòng)物的胰島素β細(xì)胞,使β細(xì)胞制造胰島素的功能發(fā)生障礙而導(dǎo)致血糖過(guò)高和糖尿病[7]。

糖尿病患者牙周病發(fā)病率及病變程度高于非糖尿病人群。在糖尿病患者中,慢性高血糖可加速糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endroducts,AGEs)的 生成 ,導(dǎo) 致 AGEs在患者血漿及組織中累積。大量的實(shí)驗(yàn)證明:在 DM患者的牙周組織中 AGEs量和 RAGE表達(dá)皆升高。對(duì)外周血清中 C-反應(yīng)蛋白、HbA1c、AGEs等生化指標(biāo)與Ⅱ型 DM患者慢性牙周炎活動(dòng)性(附著喪失程度)關(guān)聯(lián)做了相關(guān)研究。結(jié)果顯示AGEs水平與牙周炎的活動(dòng)性密切相關(guān)。且曹曉麗[8]等也發(fā)現(xiàn):糖尿病牙周炎大鼠血清中 AGEs增高是加重糖尿病牙周炎的一種因子。因此學(xué)者們認(rèn)為 AGEs水平可作為評(píng)價(jià) DM患者牙周炎是否加重的有效指標(biāo)之一。

AGEs的致病途徑可能主要是依靠與其細(xì)胞表面的受體RAGE相互作用,并激活一些列的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,影響一些細(xì)胞因子的表達(dá) ,如 IL-1,IL-6等 ,且兩者的結(jié)合同樣會(huì)使巨噬細(xì)胞表型發(fā)生改變,釋放更多炎性介質(zhì),這些炎性介質(zhì)會(huì)激活破骨細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopro-teinases,MMPs)導(dǎo)致牙槽骨吸收和牙周結(jié)締組織破壞。此外 AGEs的交聯(lián)能激活一些膠原酶的活性,造成牙周組織的膠原成分大量降解,促進(jìn)牙周附著喪失,這種高度交聯(lián)的膠原累積還會(huì)使毛細(xì)血管基底膜增厚,導(dǎo)致牙周組織血供降低,影響其愈合能力,促進(jìn)糖尿病牙周炎的發(fā)展。在 DM患者中,AGEs激活了多種致病途徑 ,多種致病途徑同樣也促進(jìn)了AGEs的形成。這樣惡性的循環(huán),導(dǎo)致糖尿病牙周炎的加重。因此控制血清中 AGEs的含量,是治療糖尿病牙周炎的重要措施之一。本實(shí)驗(yàn)中,我們可以看到:A、B組用藥4周與 6周比較,血清 AGEs的含量降低 ,同時(shí)大鼠牙齦探診出血減輕 ,牙槽骨吸收減低。且 A、B組與 C組對(duì)比,隨著 AGEs的含量的增加,大鼠牙周的炎癥增強(qiáng)。

氨基胍是 AGEs干預(yù)藥物中最經(jīng)典的藥物。它可抑制AGEs的合成和交聯(lián),目前已用于治療 DM的并發(fā)癥。且馬淑媛等人通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí) AG對(duì)牙周炎有一定的抑制作用[9]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到用藥 4,6周時(shí) B組大鼠血清 AGEs的含量明顯低于同期糖尿病牙周炎組,差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且與 C組比較大鼠的牙周炎癥減輕,牙周膠原纖維增生,牙槽骨吸收減少,可見(jiàn)大量新生的骨基質(zhì)。然而與 A組相比,在用藥4周時(shí),A組血清 AGEs的含量的要高于 B組,具有差異。但是 ,在用藥6周時(shí),兩組的 AGEs的含量比較,無(wú)明顯差異?？梢?jiàn)中藥葛根素對(duì)血清 AGEs的生成的抑制作用與氨基胍的作用相當(dāng)。在組織病理片上,我們可以看到 A、B組大鼠的牙齦上皮較連續(xù),牙周膠原纖維增生,且可見(jiàn)大量的新生骨基質(zhì)。而且 A、B組牙槽骨高度降低的數(shù)值比較無(wú)明顯差異,可見(jiàn)兩者均在一定程度上抑制了大鼠牙周炎的發(fā)展。

中藥葛根素具有改善心腦血管循環(huán)、降低心肌耗氧量,降低血糖,治療糖尿病并發(fā)癥等多種藥理作用[2]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)中,許多中藥具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能,改善體內(nèi)環(huán)境,防止骨吸收的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:應(yīng)用葛根素6周后 大鼠血清AGEs的含量,牙齦的炎癥,以及牙槽骨的吸收程度均小于糖尿病牙周炎組,具有明顯差異。與 B組氨基胍用藥組相比,其抑制牙周炎的程度相當(dāng),無(wú)明顯差異。其可能的機(jī)制:①葛根素可降低血糖,減少體內(nèi) AGEs的含量[10],進(jìn)而阻止非酶糖基化的作用,改善牙周狀況。②類(lèi)雌激素樣的作用。減少骨吸收、促進(jìn)骨形成的作用。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果顯示,中藥葛根素注射液可通過(guò)減低大鼠血清 AGEs的含量,控制血糖,進(jìn)而抑制大鼠糖尿病牙周炎的發(fā)展,其作用相當(dāng)于西藥氨基胍。

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