同一患者不同部位的4株肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制研究和同源性分析

劉 瑛，俞 靜，張 良，沈立松

肺炎克雷伯菌廣泛分布于自然界，存在于土壤和水中，人和動物腸道內更為常見。肺炎克雷伯菌可引起典型的原發(fā)性肺炎，也可引起各種肺外感染，常見有嬰兒腸炎、腦膜炎，成人泌尿系感染、外傷感染和血流感染等。碳青霉烯類抗生素是目前治療腸桿菌科細菌包括肺炎克雷伯菌，尤其是產超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）和AmpC酶等多重耐藥菌引起的嚴重感染最有效的抗菌藥物之一。近年來，隨著這類抗生素的廣泛應用，臨床逐漸出現(xiàn)了耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌，特別是耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌的報道日見增多，所涉及的國家和區(qū)域越來越廣，成為臨床抗該菌感染治療的棘手問題。

本研究收集我院臨床微生物室2012年3月從1例男性膀胱癌術后患者的血、尿、痰、盆腔引流液4種標本中分離得到的不重復的4株耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌，并對其耐藥機制和同源性進行了分析，現(xiàn)將結果報道如下。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來源 我院臨床微生物實驗室從1例男性膀胱癌術后患者的血、尿、痰和盆腔引流液中先后分離到4株對包括厄他培南和亞胺培南在內的所有臨床常用抗菌藥物均耐藥的肺炎克雷伯菌，分別命名為Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4。質控株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603，由上海市臨床檢驗中心提供。產KPC－2酶肺炎克雷伯菌（LYKPC）由上海第六人民醫(yī)院檢驗科惠贈。IMP和VIM陽性菌株由上海瑞金醫(yī)院微生物科惠贈。

（二）儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及革蘭陰性桿菌鑒定卡（GNI）、革蘭陰性桿菌藥敏卡（GN13）購自法國Bio Mérieux公司，Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR儀購自德國Eppendorf公司，ABI Prism310 Genetic Analyzer DNA測序儀購自美國 Applied Biosystems公司，SDS－PAGE電泳裝置及電泳儀購自美國Bio－Rad公司，PCR擴增試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程公司，基因測序擴增試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，厄他培南紙片（10μg）購自英國OXOID公司。

二、方法

（一）菌株鑒定和藥敏試驗 所有菌株均由VITEK－2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定及藥敏試驗，藥敏判斷標準及質控遵循2011年版CLSI［1］標準執(zhí)行。

（二）改良Hodge試驗 根據2009年版CLSI［2］推薦，將0.5麥氏單位的大腸埃希菌 ATCC 25922菌液稀釋10倍后均勻涂布在MH平皿上，中間貼10μg／片厄他培南的紙片，將受試菌株以厄他培南紙片為起點，沿離心方向劃線，35℃培養(yǎng)過夜，抑菌圈內呈現(xiàn)矢狀者為陽性。肺炎克雷伯菌ATCC 700603為陰性對照株，肺炎克雷伯菌LYKPC作為陽性對照株。

（三）PCR擴增及測序 按文獻［3］報道采用水煮法提取菌株DNA。采用PCR方法擴增碳青霉烯酶基因，包括blaKPC－2、blaIMP－1、blaIMP－2、blaVIM－1、blaVIM－2、blaNDM－1和blaOXA－487種常見基因。引物及擴增條件見參考文獻（表1）。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠成像儀觀察并攝片。

表1 7種碳青霉烯酶基因的引物Table 1 Primers of 7 carbapenemase genes

（四）基因測序 待測序的PCR擴增陽性產物經過瓊脂糖凝膠電泳分離后，割取對應位置的含清晰DNA條帶的瓊脂凝膠塊，用DNA膠回收試劑盒回收得到測序單向PCR反應的模板，單向PCR反應的具體體系與擴增程序參考BigDye Terminator v3.1測序試劑盒操作手冊，單向PCR反應產物利用ABI Prism310 Genetic Analyzer DNA測序儀測序。

（五）外膜蛋白SDS－PAGE電泳分析 通過超聲破壁法制備肺炎克雷伯菌外膜蛋白［9］，從細菌細胞膜蛋白成分中分離得到月桂酰肌氨酸鈉不溶的蛋白組分作為外膜蛋白樣品，對外膜蛋白樣品進行SDS－PAGE電泳分析，電泳結束后采用考馬斯亮藍R250染色。

（六）ERIC－PCR DNA 指紋圖譜分析 ERICPCR方法對4株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌和另1株同期分離自同一科室其他患者的尿標本中肺炎克雷伯菌（Kpsck5）進行同源性分析。引物序列為5－AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG－3［3］，PCR 反應體系和反應條件參見文獻［10］。

結 果

一、菌株鑒定和藥敏試驗結果

4株分離自血、尿、痰和盆腔引流液標本的菌株經VITEK2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定均為肺炎克雷伯菌，生化編碼均為：6607734653564010。藥敏結果顯示，4株細菌除了對厄他培南（MIC≥8 mg／L）和亞胺培南（MIC≥16 mg／L）耐藥外，還對頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨芐西林－舒巴坦、哌拉西林－他唑巴坦、頭孢替坦、氨曲南、阿卡米星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑耐藥（表2）。

表2 4株肺炎克雷伯菌的藥敏試驗結果（mg／L）Table 2 The antimicrobial susceptibility of the 4 K.pneumoniae strains（mg／L）

二、改良Hodge試驗

4株肺炎克雷伯菌改良Hodge試驗結果均呈陽性（圖1）。

圖1 肺炎克雷伯菌（Kpsck1）的改良Hodge試驗結果Figure 1 Modified Hodge test result of Klebsiella pneumoniae（Kpsck1）

三、耐藥基因檢測及基因測序

對7種耐藥基因進行PCR擴增，4株肺炎克雷伯菌均在1 000 bp左右，有KPC－2基因的陽性擴增條帶（圖2）。PCR產物測序后于美國NCBI網站Blast軟件比對，證明PCR產物為KPC－2基因。4株 細 菌 均 未 檢 測 到 blaIMP－1、blaIMP－2、blaVIM－1、blaVIM－2、blaNDM－1和blaOXA－48等耐藥基因。

四、外膜蛋白組分分析

外膜蛋白SDS－PAGE電泳分析結果顯示，Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4的外膜蛋白圖譜完全相同，但與肺炎克雷伯菌ATCC700603的外膜蛋白圖譜不同。Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3、Kpsck4及肺炎克雷伯菌ATCC700603的外膜蛋白中均存在35 ku左右的蛋白條帶。肺炎克雷伯菌ATCC700603表達的外膜蛋白中存在約36 ku的蛋白條帶，Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4的外膜蛋白圖譜中缺失36 ku大小的蛋白條帶，而出現(xiàn)了一條分子量大于36 ku的異常蛋白條帶（圖3）。

圖2 KPC－2基因PCR擴增電泳圖譜Figure 2 Electrophoresis of KPC－2 PCR amplification products

圖3 肺炎克雷伯菌的外膜蛋白SDS－PAGE分析Figure 3 SDS－PAGE analysis of Klebsiella pneumoniae outer membrane porin

五、ERIC－PCR指紋圖譜

ERIC－PCR試驗的結果顯示，Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4具有完全相同的DNA指紋圖譜（圖4），表明4株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌是同一克隆株。

討 論

圖4 5株肺炎克雷伯菌的ERIC－PCR指紋圖譜Figure 4 ERIC－PCR fingerprinting profiles of Klebsiella pneumoniae

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素的主要耐藥機制是產碳青霉烯酶，且以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）為多見。KPC酶屬于Ambler分類的A類絲氨酸β內酰胺酶，2001年在美國北卡羅來納州報道發(fā)現(xiàn)第1株產KPC酶的肺炎克雷伯臨床分離株［11］。自此之后KPC型β內酰胺酶在諸多腸桿菌科細菌中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的KPC型酶達13種［12］。本研究中的4株肺炎克雷伯菌均檢出KPC－2基因，而其他 Ambler B類酶包括IMP、VIM、NDM－1等金屬酶及D類OXA－48型酶均未檢出。因此，產KPC－2型碳青霉烯酶是這4株細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的耐藥機制。KPC基因通常存在于可傳播的含有轉座子的質粒中，這可使細菌耐藥性在不同種的細菌之間水平傳播［13］，增加了細菌獲得耐藥性的機會，引起醫(yī)院內耐藥菌的播散和流行，對控制醫(yī)院感染和臨床治療是巨大的挑戰(zhàn)。

外膜蛋白是細菌與外界進行物質交換的重要通道，改變通道蛋白性質和數量而降低細菌的膜通透性可以使細菌產生耐藥性。肺炎克雷伯菌產生的主要外膜蛋白是OmpK35和OmpK36。已有文獻報道，碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌中缺失36 ku大小的外膜蛋白組分而引起細菌耐藥性增強［14－15］。本研究中Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4的外膜蛋白圖譜中均缺失36 ku大小的蛋白條帶，而出現(xiàn)了一條分子量大于36 ku的異常蛋白條帶，異常外膜蛋白組分引起的細胞膜滲透性的改變與其碳青霉烯類耐藥性相關，也可能導致此4株細菌的多重耐藥性。因此，本研究中的4株耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌的主要耐藥機制為產KPC－2酶合并外膜蛋白異常引起的外膜蛋白通透性改變。

ERIC－PCR主要是以腸桿菌科細菌基因間非編碼區(qū)的重復共有序列為基礎進行的PCR擴增，是一種簡單、靈敏度高、可重復性和可靠性較好的分子生物學分型方法，可對腸桿菌科細菌的同源性進行分析。本研究中該例患者4個部位標本中均檢出耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌，且結果顯示為同一克隆型。表明該例患者是多臟器的全身泛耐藥肺炎克雷伯菌感染。

Hussein等［16］和 Gasink等［17］通過臨床資料對比研究，發(fā)現(xiàn)了感染碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌的6種獨立危險因素?；仡櫞嘶颊叩呐R床資料：年齡79歲，因膀胱癌行根治性膀胱切除術，4周后首次從尿標本中分離到泛耐藥肺炎克雷伯菌，期間曾先后進行了帕尼培南、左氧氟沙星、亞胺培南和萬古霉素等抗菌藥物治療，具備感染碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌的危險因素。值得一提的是，該患者的臨床標本分離到耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌后，臨床選用了阿莫西林－克拉維酸、磷霉素和多西環(huán)素治療，而后對患者血、尿、痰及盆腔引流液標本進行細菌培養(yǎng)，結果均為陰性。此案例說明，盡管藥敏試驗結果顯示分離自患者的肺炎克雷伯菌為泛耐藥株，但通過合適的抗菌藥物治療，尤其聯(lián)合用藥后細菌感染得到控制，這也給類似嚴重感染患者的治療方案提供了參考依據。

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