黃姜皂素重量測(cè)定法存在問(wèn)題及原因探析

黃娟萍

（旬陽(yáng)縣科技局，陜西 旬陽(yáng) 725700）

黃姜，學(xué)名盾葉薯蕷，是薯蕷科薯蕷屬（Dioscrea.L）多年生草質(zhì)纏繞藤本植物。世界上薯蕷科共有10屬650種，廣布于熱帶地區(qū)，中國(guó)有薯蕷屬 80余種，其中富含薯蕷皂苷元的有17種。中國(guó)是盾葉薯蕷的原產(chǎn)地，兩千多年前的《山海經(jīng)》中就有“景山、北望少澤，其草多薯蕷” 的記載。是世界上薯蕷皂苷元含量最高的種。被《中華人民共和國(guó)藥典》（2000版）收載，其根莖中薯蕷皂苷元（disogenin）（俗稱(chēng)皂素）的含量為1.1%～16.15%，是合成甾體激素類(lèi)（steroid hormone）藥物和甾體避孕藥（steroid prophylactic）的重要醫(yī)藥化工原料。

影響黃姜皂素含量的因素較多，除分布區(qū)、海拔、土壤、水分、溫度、光照等環(huán)境因子外，還有些其它因子。蔣朝暉等對(duì)盾葉薯蕷生育期皂苷元含量變化規(guī)律研究認(rèn)為，皂苷在根莖中積累高峰期是現(xiàn)蕾及盛花期，結(jié)實(shí)期后明顯下降；丁志遵等研究認(rèn)為，盾葉薯蕷一般在萌芽期至開(kāi)花盛期皂苷含量較高，老根莖皂苷含量高于新根莖；水分含量高的根莖皂苷含量亦高。李朝陽(yáng)等研究認(rèn)為，盾葉薯蕷的皂苷元含量與葉片寬窄程度之間也存在一定的相關(guān)性，寬葉型的平均皂苷元含量都較高，而長(zhǎng)葉型的皂苷元含量都不高；潭遠(yuǎn)友等研究發(fā)現(xiàn)，盾葉薯蕷雄株中皂苷元含量高于雌株，種植時(shí)期越長(zhǎng)，皂苷元含量越高。這些研究為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃姜提供有力的科學(xué)依據(jù)，也為黃姜的合理開(kāi)發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 重量檢測(cè)法的理論依據(jù)

薯蕷皂苷元是薯蕷屬植物中薯蕷皂苷的配基，主要以薯蕷皂苷的形式與纖維素結(jié)合存在于黃姜的薄壁細(xì)胞中。薯蕷皂苷元是異螺旋甾烷的衍生物，在植物體內(nèi)是以薯蕷皂苷配基形式存在的，即在 C3位通過(guò)皂苷鍵與糖鏈相連進(jìn)而與植物細(xì)胞壁緊密連接。由于盾葉薯蕷皂苷元的結(jié)構(gòu)特征和它在植物體內(nèi)的存在形式，決定了提取它的步驟：首先必須使薯蕷皂苷元與植物細(xì)胞壁分開(kāi)，再斷開(kāi)薯蕷皂苷元與糖連接的苷鍵，使薯蕷皂苷元游離出來(lái)，利用它的親脂性，用丙酮或石油醚把它提取出來(lái)，盾葉薯蕷工業(yè)上用高標(biāo)號(hào)的汽油來(lái)提取。

報(bào)道的薯蕷皂苷元的含量測(cè)定方法有多種，經(jīng)典方法有重量法、比色法、庫(kù)倫法，紅外光譜法和薄層掃描法；現(xiàn)代方法有氣相色譜法、高效液相色譜法（RP PHLC）等。重量檢測(cè)法從20世紀(jì)50年代末一直沿用，此法操作直觀，易于掌握，（除此檢查法，其余都是采用光學(xué)儀器進(jìn)行測(cè)量）此法包括直接酸水解法和預(yù)發(fā)酵酸水解法。

酸水解是使苷鍵斷裂生成苷元和糖。傳統(tǒng)的提取薯蕷皂苷元的方法是采用直接酸水解Rothrock法，即直接將盾葉薯蕷根莖用硫酸水解成苷元，然后用有機(jī)溶劑提取薯蕷皂苷元。郭文松等報(bào)道，用鹽酸作為水解酸比硫酸好，工藝簡(jiǎn)單，效果差異不大，同時(shí)以鹽酸為水解液時(shí)，加壓法比常壓法水解苷元收率高，缺點(diǎn)是鹽酸對(duì)不銹鋼設(shè)備有嚴(yán)重腐蝕。薯蕷皂苷元在植物體內(nèi)存在形式的復(fù)雜性，使直接酸水解法僅能提取 1/4的皂苷元，且此法費(fèi)時(shí)很多，薯蕷皂素收率較低，由于使用溶劑汽油，易發(fā)生危險(xiǎn)；另外，盾葉薯蕷中的淀粉和纖維素等其它成分也在酸水解過(guò)程中被破壞而不能利用，因此該工藝不夠理想。

預(yù)發(fā)酵法，一般認(rèn)為預(yù)發(fā)酵法可提高薯蕷皂苷元的收率。反應(yīng)條件也比較溫和，保持了有效成分的本來(lái)理化性質(zhì)，適合實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)使用。就是我們目前采用的檢測(cè)方法。

2 預(yù)發(fā)酵酸水解檢測(cè)法的主要操作流程

主要工藝流程，見(jiàn)圖1。

圖1 皂素生產(chǎn)工藝流程圖

第一，從種質(zhì)資源圃中取回休眠的黃姜新鮮塊莖，洗凈表皮及須根上的細(xì)沙泥土雜質(zhì)，除去腐爛、蟲(chóng)害的部分。瀝干水，切碎，在自然條件下晾曬，使其水分達(dá)到20～30 %即可，再用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)90目篩子。

第二，取黃姜干粉80 g，加40 ℃的水適量（黃姜粉：水＝1∶3）攪拌均勻，使其充分吸水至飽和。用塑料紙包嚴(yán)封口，置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵至48 h，取出后有氣泡和薯蕷粉的酒香味。

第三，發(fā)酵好的樣品移入1000 ml燒瓶中，加入適量水、濃鹽酸配制成2個(gè)當(dāng)量濃度的水解液，塞上帶空氣冷凝管的膠塞，置800 W的電爐（溫度控制在104 ℃）反復(fù)回流4 h。

第四，過(guò)濾，用蒸餾水沖洗水解渣至中性（pH＝7）。

第五，將其置于80℃恒溫箱6 h烘干，并稱(chēng)重打包。

第六，用120號(hào)汽油置索氏提取器中萃取6 h。然后取玻璃皿，接少量提取汽油于皿中，揮干，加入數(shù)滴醋酸酐，將沉淀溶解，沿皿壁加入濃硫酸一滴，觀察相交面是否有紫紅色，反應(yīng)出現(xiàn)，有為陽(yáng)性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)提取，無(wú)反應(yīng)說(shuō)明已提取完成。

第七，靜置12 h以上，用真空泵離心抽濾，洗出皂素。

第八，置80 ℃恒溫箱1.5 h烘干皂素稱(chēng)重。

第九，精確計(jì)算出生藥皂素含量和水解干燥物收率。

3 重量檢測(cè)法存在的主要問(wèn)題

目前這種重量檢測(cè)皂素的方法在試驗(yàn)室和大工廠普遍使用。雖然安康地區(qū)使用該法近10年時(shí)間，僅旬陽(yáng)縣黃姜研究所就做了1358個(gè)樣品，但筆者認(rèn)為該法還是存在一定的不足，主要表現(xiàn)在：

第一，樣品的前期處理過(guò)程復(fù)雜，要求器械精度高。首先要洗凈，不能有殘余的任何雜質(zhì)，像泥巴細(xì)沙之類(lèi)的，也不能有腐爛蟲(chóng)害的部分。其次要求粉碎程度高，必須先用菜刀切碎成細(xì)小顆粒，再晾干，粉碎（用紡錘形刀片的萬(wàn)能粉碎機(jī)），過(guò)篩。最后，還要在發(fā)酵之前使粉末充分吸水，脹破細(xì)胞壁。

第二，該檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，人力、水、電消耗量大。檢測(cè)一個(gè)黃姜樣品，除去樣品前期處理時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室還要?dú)v時(shí)70 h左右。消耗電力50余度，水3 t，需要安排6個(gè)工作日。

第三，此法由于影響因素較多，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，平行樣檢測(cè)出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在誤差，甚至有時(shí)誤差較大。為了提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，又要耗費(fèi)更多的人力和財(cái)力。

4 重量檢測(cè)法存在問(wèn)題的主要原因

通過(guò)聯(lián)合高等院校專(zhuān)家教授分析，加上我們自己不斷對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生上述問(wèn)題的原因主要有以下幾個(gè)方面：

第一，原料的粉碎狀況，粉碎的粒度以現(xiàn)有條件達(dá)不到實(shí)驗(yàn)的要求。在發(fā)酵過(guò)程中，黃姜粉末顆粒不能充分吸水，植物細(xì)胞壁不能徹底完全脹破，薯蕷皂苷元與植物細(xì)胞壁不能完全分開(kāi)，皂苷元與糖連的側(cè)鏈不能完全斷裂斷裂，影響后續(xù)皂素的分離。

第二，因黃姜本身含有大量的淀粉（50%）和纖維素（45～50%）（以干姜計(jì)），在發(fā)酵過(guò)程和水解時(shí)，就會(huì)直接干擾黃姜皂素的分離，使皂素?zé)o法完全徹底從皂甙中游離出來(lái)而與酸結(jié)合，從而殘留在廢渣中。

第三，即使有合適的水解條件，如果酸濃過(guò)高就可能有30%或更多脫水產(chǎn)物——去氧替告皂甙元生成，測(cè)出皂素含量高，但熔點(diǎn)低，皂素品質(zhì)下降，而且△3，5－去氧替告皂苷元很難與皂素分離，增加了后續(xù)工藝流程的難度。

第四，水解后的干燥物（烘干至水分含量在6～10%）水分過(guò)大，影響溶劑和料面的接觸，不能完全提取。

第五，提取溫度的控制（80 ℃）：溫度低，則提取率低，若溫度高，則產(chǎn)品色澤較深。如果干燥物粒度直徑不在5～10 mm，即使提高溫度，延長(zhǎng)時(shí)間也無(wú)濟(jì)于事。

第六，洗皂素：因反復(fù)的沖洗，致使部分皂素順著布氏漏斗與濾紙的邊緣流進(jìn)母液而不能回收，使所測(cè)數(shù)據(jù)偏低。

5 重量檢測(cè)法存在問(wèn)題解決的思考

針對(duì)上述問(wèn)題及其原因，一方面我們要通過(guò)反復(fù)實(shí)踐完善實(shí)驗(yàn)操作流程，具體方法如下：①多做樣品的平行樣，減少誤差；②是勤于觀察實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)現(xiàn)象，使實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件充分，提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；③是提高業(yè)務(wù)水平，規(guī)范操作，減少人為原因存在的問(wèn)題。另一方面應(yīng)聯(lián)系相關(guān)科研院校，盡快將其已研究成功并獲得專(zhuān)利的高、精、尖的最新測(cè)定方法引入我市，如武漢大學(xué)生命科學(xué)院獲取專(zhuān)利的酶聯(lián)吸附法，該檢測(cè)方法是目前色譜法外最快速、靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的測(cè)量方法。此法除去樣品的前期處理時(shí)間，檢測(cè)一個(gè)樣品僅需7～8 h，且同時(shí)可檢測(cè)96個(gè)樣品。該方法不存在強(qiáng)腐蝕、高危險(xiǎn)的隱患。再如二氧化碳超導(dǎo)法以及四川大學(xué)王南教授在旬陽(yáng)恒源化工有限公司領(lǐng)創(chuàng)的酶解法提取盾葉薯蕷皂素技術(shù)。此方法與我們現(xiàn)使用的重量法最大的區(qū)別是不用發(fā)酵，直接用酶解替代酸解，簡(jiǎn)便易行。

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