光鏡下突觸數(shù)——陽性突觸素顆粒數(shù)的體視學(xué)估計(jì)

彭 彬，林菁艷，楊正偉

(1.川北醫(yī)學(xué)院細(xì)胞化學(xué)研究室;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科;3.川北醫(yī)學(xué)院形態(tài)定量研究室，四川南充 637000)

突觸是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與效應(yīng)細(xì)胞之間信息傳遞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其數(shù)量是反應(yīng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能狀態(tài)的重要參數(shù)。突觸的可塑性，即一定條件下其形態(tài)(包括數(shù)量等)與功能的改變［1-2］，是近年來神經(jīng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。發(fā)育、學(xué)習(xí)與記憶以及衰老與疾病可能伴隨突觸的生成與解離(突觸更新)［3-5］，從而引起突觸數(shù)量的改變，這是突觸傳遞效能可塑性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因此估計(jì)特定功能區(qū)域的器官組織內(nèi)突觸數(shù)量的變化在疾病機(jī)制及藥效評(píng)價(jià)研究中具有重要意義。

突觸由突觸前成分、突觸間隙和突觸后成分組成，只有用電鏡才能清晰觀察。但電鏡切片(超薄切片)太薄，難以在切片內(nèi)連續(xù)“斷層掃描”觀察突觸，因此我們必須采用多張連續(xù)電鏡切片根據(jù)物理體視框技術(shù)進(jìn)行突觸數(shù)估計(jì)［6］。Tang 等［7-9］就用這樣的方法估計(jì)過突觸數(shù)。但這樣估計(jì)突觸數(shù)不僅要作連續(xù)超薄切片，還要在不同切片上的相同部位拍照、觀察并計(jì)數(shù)突觸;不僅要注意保證計(jì)數(shù)足夠數(shù)量的突觸，還要注意估計(jì)切片厚度(以估計(jì)體視框的高度)。這些都是比較困難的。

突觸的突觸前成分包括突觸前膨大和突觸前膜兩部分，在光鏡下為直徑約0.5 μm至數(shù)微米不等的紐扣狀結(jié)構(gòu)，稱為終扣，內(nèi)含大量突觸小泡［10］。人們發(fā)現(xiàn)，突觸小泡有一種分子量為38 KD的酸性鈣結(jié)合糖蛋白——突觸素(英文可縮寫成 SYP、SYN、p38)，它特異性地分布于突觸小泡的膜上，幾乎存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的所有神經(jīng)末梢［11-12］。由于突觸素的發(fā)現(xiàn)，人們從1985年開始采用組化技術(shù)在光鏡下顯示并觀察突觸——突觸素陽性顆粒，它實(shí)際上是成簇的突觸小泡［13］，因此，光鏡下觀察的突觸素顆粒數(shù)，可以反映突觸數(shù)?，F(xiàn)在已有研究［14-16］用體視學(xué)方法在光鏡下估計(jì)突觸素顆粒數(shù)，并以此反映突觸數(shù)。例如，我們?cè)烙?jì)過大鼠脊髓背角內(nèi)的突觸素顆粒數(shù)，發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)切斷或松結(jié)扎所致神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致脊髓背角內(nèi)突觸素顆粒數(shù)增加70%以上［15-16］。雖然突觸素顆粒數(shù)未必完全等于突觸數(shù)，突觸素顆粒數(shù)與突觸數(shù)之間的差異以及突觸素顆粒數(shù)與突觸傳遞功能的關(guān)系等尚需研究確定，但由于在光鏡下估計(jì)突觸素顆粒數(shù)遠(yuǎn)比在電鏡下估計(jì)突觸數(shù)簡便得多，我們認(rèn)為值得推廣運(yùn)用。下面介紹光鏡下估計(jì)突觸素顆粒數(shù)的基本方法以及我們的經(jīng)驗(yàn)體會(huì)。

1 切片制備

1.1 切片與染色

石蠟切片或冰凍切片均可用于突觸素免疫組化染色［14-17］，其中石蠟切片是最常用、最基本的方法。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫組化常用的染色方法有免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法與親和組織化學(xué)法，后者敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中抗生物素-生物素方法最常用［18］。

尤其要注意的是，封片劑有水溶性和油溶性兩種，由于水溶性封片劑不能長期保存且蓋玻片容易脫落。因此，最后封片要用油溶性封片劑，國內(nèi)常用的是中性樹膠。用它封片后切片將干燥、固定，便于用油鏡觀察(見下面)。此外，與水溶性封片劑相比，中性樹膠與鏡油的折光率更一致［19］，這樣才能更準(zhǔn)確的測(cè)量體視框的高度(見下面)。

1.2 切片厚度

突觸素顆粒呈棕黃色的顆粒狀、點(diǎn)狀或圈狀(圖1、圖2)。根據(jù)我們的測(cè)量，其直徑為0.6～1.5 μm(平均約0.9 μm)。因此，從利于辨認(rèn)與計(jì)數(shù)的角度考慮，我們以為實(shí)際測(cè)量(用于突觸素顆粒計(jì)數(shù))的切片厚度不宜小于3 μm。考慮到切片上表面約1 μm的組織可能凹凸不平、存在組織破壞甚至染色不佳，因此我們不計(jì)數(shù)這個(gè)厚度(監(jiān)視厚度)的切片組織，而從其下面的聚焦平面開始計(jì)數(shù)。又考慮到切片厚度的變異［20］，實(shí)際觀測(cè)切片(染色后的切片)的厚度應(yīng)不宜小于5 μm。再考慮到切片染色過程中的切片壓縮［20］，石蠟切片的厚度(切片機(jī)設(shè)定的切片厚度)可能不宜小于7 μm。

我們?cè)檬炃衅旧@示突觸素顆粒，切片機(jī)設(shè)定的切片厚度是14 μm，由于切片、染色過程中的切片壓縮，最后實(shí)際觀測(cè)切片的厚度約為10 μm。突觸素顆粒染色可穿透整個(gè)這個(gè)厚度的切片，即整個(gè)切片厚度內(nèi)均可見陽性突觸素顆粒［15-16］。

2 突觸素顆粒計(jì)數(shù)

突觸素顆粒計(jì)數(shù)的基本方法是光學(xué)體視框，其基本方法如下［6］:用油鏡攝取圖像，在電腦顯示屏上觀察;均勻隨機(jī)抽選測(cè)試視野，在視野上疊加一定數(shù)量的測(cè)點(diǎn)和禁線框(圖1、圖2);先在切片的上表面聚焦，然后手動(dòng)向下移動(dòng)一定距離(監(jiān)視厚度)，從此聚焦平面開始，再向下連續(xù)聚焦一定距離(計(jì)數(shù)厚度)的切片組織，邊聚焦邊觀察并計(jì)數(shù)(這個(gè)厚度的切片組織內(nèi))禁線框“內(nèi)”新出現(xiàn)的突觸素顆粒(圖1、圖2)。這里，計(jì)數(shù)顆粒的空間即體視框，其底面積為禁線框的面積，高為用于計(jì)數(shù)的切片組織的厚度(計(jì)數(shù)厚度)。通過上下移動(dòng)油鏡而在厚切片內(nèi)連續(xù)觀察的聚焦平面即光學(xué)切片(不是用切片機(jī)切的物理切片)，因此這種技術(shù)叫光學(xué)體視框。

應(yīng)注意:①用光學(xué)體視框的計(jì)數(shù)既要用油鏡，也要用中性樹膠封固切片。用油鏡不僅僅是為了能清晰地連續(xù)“斷層掃描”觀察切片及結(jié)構(gòu)，也是為了更準(zhǔn)確的測(cè)量光學(xué)切片的移動(dòng)距離(體視框高度)，因?yàn)殓R油(與空氣相比)的折光率與切片組織(樹膠封固)的折光率更一致［19］，這樣測(cè)量的載物臺(tái)(或油鏡)移動(dòng)距離才更準(zhǔn)確的反映體視框高度。②為估計(jì)用于顆粒計(jì)數(shù)的體視框的數(shù)量或總體積，在每個(gè)視野上要定義一定數(shù)量的測(cè)點(diǎn)，并計(jì)數(shù)位于所測(cè)組織區(qū)域內(nèi)的測(cè)點(diǎn)數(shù)，以此估計(jì)用于顆粒計(jì)數(shù)的所測(cè)組織(體視框)的總體積［6］。

3 突觸素顆粒數(shù)估計(jì)

用于計(jì)數(shù)突觸素顆粒的禁線框有一定面積a，將之乘以體視框高度h以及所用禁線框總數(shù)n(根據(jù)測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)估計(jì)，見上述)，即得體視框的總體積V(V=a×h×n)。結(jié)合所計(jì)數(shù)到的突觸素顆粒總數(shù)Q-，即可估計(jì)所測(cè)組織內(nèi)突觸素顆粒的數(shù)密度NV(=Q-/V)。再結(jié)合所測(cè)器官組織(經(jīng)一系列組織處理后的器官組織)的總體積V’，即可估計(jì)所測(cè)器官組織內(nèi)的顆粒總數(shù)N(=NV×V’)。

吳亮生等［14］曾用這種方法估計(jì)過大鼠松果體內(nèi)的突觸素顆?？倲?shù)。這種方法中，處理后器官組織的體積V'估計(jì)較難［6］。為避免估計(jì)這個(gè)體積，我們可采用分合法(結(jié)合光學(xué)體視框)進(jìn)行估計(jì)［6］，也可在計(jì)數(shù)突觸素顆粒的同時(shí)，計(jì)數(shù)數(shù)量較穩(wěn)定的神經(jīng)元的數(shù)量，以突觸素顆粒和神經(jīng)元數(shù)量之比反映突觸素顆粒總數(shù)［15-16］，見下面的實(shí)例。

4 實(shí)例:L5節(jié)段脊髓背角內(nèi)突觸素顆粒數(shù)的估計(jì)

4.1 切片制備

4月齡SD大鼠1只，作左側(cè)坐骨神經(jīng)松結(jié)扎［15］，28 d后用4%多聚甲醛經(jīng)心臟進(jìn)行灌注固定，然后打開椎管并根據(jù)脊神經(jīng)根的位置沿垂直于脊髓長軸的方向切取脊髓腰膨大(L4～L6)。用4%多聚甲醛浸潤固定(后固定)腰膨大24 h，用70%乙醇脫水2 d，然后沿垂直于脊髓長軸的方向?qū)⒀虼缶鶆蚯蟹殖?塊(每塊約2 mm厚)，取其中第3或第4塊(即中間2塊中的1塊)做石蠟包埋。(之所以只取1塊，一方面是為了減少工作量，另一方面是因?yàn)檫@其中1塊是坐骨神經(jīng)在脊髓的主要投射區(qū)域。)從石蠟包埋的組織塊連續(xù)切取30張14 μm厚的連續(xù)切片(脊髓橫斷面切片)，從中等距隨機(jī)抽選5張(第1張切片從第1～6張連續(xù)切片中隨機(jī)抽選，以后每6張抽選1張)用于甲苯胺藍(lán)染色，另等距隨機(jī)抽選5張用于突觸素免疫組化染色。切片、裱片過程中特別注意了脊髓切片的頭尾側(cè)或左右側(cè)方向。

4.2 染色方法

甲苯胺藍(lán)染色方法:常規(guī)脫蠟至水后，切片放入57℃的0.01%甲苯胺藍(lán)溶液中染色5 min，再經(jīng)95%乙醇分色1 min，常規(guī)脫水、透明及中性樹膠封片。

突觸素免疫組化染色方法:常規(guī)脫蠟至水后，切片放入3%H2O2孵育10 min，再經(jīng)熱抗原修復(fù)，山羊血清封閉15 min，然后用突觸素(synaptophysin)的小鼠單克隆抗體(1∶200)孵育(4℃)過夜;接著依次用生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG和辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素(S-A/HRP)各孵育(37℃)15 min，最后在室溫下用DAB顯色4 min，蘇木精復(fù)染4 min，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

4.3 體視學(xué)估計(jì)

4.3.1 突觸素顆粒數(shù)估計(jì) 用體視學(xué)圖像系統(tǒng)(丹麥Visiopharm產(chǎn)品)觀測(cè)突觸素顆粒染色切片(5張)。先在4×物鏡下用光標(biāo)圈定擬測(cè)的脊髓背角區(qū)域，然后用100×油鏡(UPlanSApo，NA 1.40)觀察切片，切片圖像在電腦顯示屏上的最后放大倍數(shù)為2 240。先設(shè)定視野抽樣面積(實(shí)測(cè)視野面積)為脊髓背角區(qū)域面積的0.5%，然后依次等距隨機(jī)抽選并觀察視野。在每個(gè)視野上疊加9個(gè)測(cè)點(diǎn)及4個(gè)禁線框(每個(gè)面積為57.62 μm2)，見圖1。先計(jì)數(shù)位于脊髓背角內(nèi)的測(cè)點(diǎn)數(shù)，然后計(jì)數(shù)每個(gè)禁線框“內(nèi)”的突觸素顆粒數(shù):先在切片上表面聚焦，然后向下移動(dòng)0.5 μm(監(jiān)視厚度)，從此計(jì)數(shù)平面開始，手動(dòng)向下連續(xù)聚焦7 μm(計(jì)數(shù)厚度)，同時(shí)觀察并計(jì)數(shù)在這7 μm厚的切片組織內(nèi)禁線框里新出現(xiàn)的突觸素顆粒。

5張切片中，位于左側(cè)脊髓背角內(nèi)的測(cè)點(diǎn)總數(shù)(P左)為404，背角里計(jì)數(shù)到的突觸素顆粒數(shù)()總共為694。右側(cè)脊髓背角內(nèi)的測(cè)點(diǎn)總數(shù)(P右)為435，背角里計(jì)數(shù)到的突觸素顆粒數(shù)()總共為425。

每個(gè)測(cè)點(diǎn)所關(guān)聯(lián)的體視框的體積(VP)為179.26μm3=(4×57.62×7/9)μm3。左側(cè)脊髓背角內(nèi)突觸素顆粒的數(shù)密度:

5張切片左側(cè)脊髓背角區(qū)域的總面積A左為:(P左×4×57.62/9)/0.5% =2.07 mm2，因此左側(cè)脊髓背角區(qū)域橫斷面的平均面積為 0.41 mm2(=A左/5)?；诖?，單位長度(例如每毫米長)脊髓的左側(cè)脊髓背角內(nèi)的突觸素顆?？倲?shù)為:

NL(左)=NV(左)×=3.93×106(mm-1)

同樣地，單位長度右側(cè)脊髓背角內(nèi)的突觸素顆?？倲?shù)為:

NL(右)=NV(右)×=2.45×106(mm-1)

鑒于新鮮脊髓組織在固定、脫水、染色、封片等步驟中會(huì)縮短約43%［15-16］，因此單位長度新鮮脊髓的左側(cè)脊髓背角內(nèi)的突觸素顆?？倲?shù)為:

NL(左)×(100%-43%)=2.24×106(mm-1)

單位長度新鮮脊髓的右側(cè)脊髓背角內(nèi)的突觸素顆粒總數(shù)為:

NL(右)×(100%-43%)=1.40×106(mm-1)

4.3.2 神經(jīng)元數(shù)估計(jì) 如上所述，用體視學(xué)圖像系統(tǒng)觀測(cè)甲苯胺藍(lán)染色切片(5張)。不過，這里計(jì)數(shù)的是脊髓背角內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞核的核仁，每個(gè)視野只測(cè)了1個(gè)面積為2 074 μm2的禁線框，實(shí)測(cè)視野面積為脊髓背角面積的5%。

5張切片里，位于左側(cè)脊髓背角內(nèi)的測(cè)點(diǎn)總數(shù)(P左)為576，背角里計(jì)數(shù)到的神經(jīng)元(核仁)數(shù)()總共為105。右側(cè)脊髓背角內(nèi)的測(cè)點(diǎn)總數(shù)(P右)為543，背角里計(jì)數(shù)到的神經(jīng)元(核仁)數(shù)()總共為108。

根據(jù)上述計(jì)算方法，單位長度脊髓(處理后，非新鮮)的左側(cè)脊髓背角內(nèi)的神經(jīng)元總數(shù)為60.00×103(mm-1)，單位長度(處理后)右側(cè)脊髓背角內(nèi)的神經(jīng)元總數(shù)為61.71×103(mm-1)。

4.3.3 突觸素顆粒與神經(jīng)元數(shù)量之比 把處理后左側(cè)單位長度脊髓背角內(nèi)的突觸素顆粒總數(shù)，除以處理后左側(cè)單位長度脊髓背角內(nèi)的神經(jīng)元總數(shù)，即得左側(cè)脊髓背角內(nèi)突觸素顆粒與神經(jīng)元數(shù)量之比為65.50。同樣獲得右側(cè)脊髓背角內(nèi)突觸素顆粒與神經(jīng)元數(shù)量之比，結(jié)果為39.70。這兩個(gè)(左側(cè)與右側(cè))結(jié)果說明了左側(cè)坐骨神經(jīng)松結(jié)扎使左側(cè)腰膨大脊髓背角內(nèi)的突觸素顆粒數(shù)增加了65%(與右側(cè)相比)。對(duì)此項(xiàng)結(jié)果解釋說明:假設(shè)坐骨神經(jīng)松結(jié)扎在不同動(dòng)物的左、右兩側(cè)交替進(jìn)行，假設(shè)65.50和39.70分別為結(jié)扎側(cè)與對(duì)側(cè)(對(duì)照)的平均結(jié)果(突觸素顆粒與神經(jīng)元數(shù)量之比)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，那么這兩個(gè)結(jié)果說明坐骨神經(jīng)松結(jié)扎使結(jié)扎側(cè)腰膨大脊髓背角內(nèi)的突觸素顆粒數(shù)增加了65%(與對(duì)側(cè)相比)。這是因?yàn)?，假設(shè)坐骨神經(jīng)松扎術(shù)不會(huì)影響任一側(cè)脊髓背角內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量，那么任一側(cè)脊髓背角內(nèi)突觸素顆粒與神經(jīng)元數(shù)量之比的增減即突觸素顆粒數(shù)的增減［15-16］。

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