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      紅三葉異黃酮對(duì)低溫誘發(fā)肉雞腹水綜合癥發(fā)生和抗氧化性能的影響

      2013-08-20 04:07:34姜義寶楊玉榮馮長(zhǎng)松王成章崔國(guó)文
      草業(yè)學(xué)報(bào) 2013年2期
      關(guān)鍵詞:紅三葉異黃酮腹水

      姜義寶,楊玉榮,馮長(zhǎng)松,王成章,崔國(guó)文

      (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450002;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150030)

      肉雞腹水綜合癥(ascites syndrome,AS)又稱肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合癥(pulmonary hypertension syndrome,PHS),是一種由多種致病因子引起的非傳染性疾病,以右心肥大-腹水形成為特征的主要發(fā)生于商品代肉仔雞的一種綜合癥侯群。近年來(lái)該病的發(fā)生率呈上升趨勢(shì),成為困擾肉雞養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重疾病之一,造成巨大的損失。肉雞AS的原發(fā)性因素是缺氧性肺動(dòng)脈高壓,一些學(xué)者研究認(rèn)為自由基的介導(dǎo)機(jī)制可能是肉雞AS發(fā)生的病因。快速生長(zhǎng)的肉雞對(duì)氧的大量需要,機(jī)體供氧不足導(dǎo)致組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基,消耗體內(nèi)的抗氧化物質(zhì),引起AS患雞體內(nèi)抗氧化防御體系功能降低,使生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA變異,將損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,缺氧條件下自由基促發(fā)血管收縮、重構(gòu)和血栓形成,肺動(dòng)脈壓升高,導(dǎo)致AS的發(fā)生[1,2]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明,氧自由基的增多以及清除自由基的物質(zhì)減少或活性降低,在肺動(dòng)脈高壓等血管性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[3]。肉雞飼養(yǎng)過(guò)程中添加抗氧劑,能夠減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷,有效的預(yù)防和治療AS。補(bǔ)硒和添加Ve可明顯地減緩脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),降低AS的死亡率[4]。齊永華和王文魁[5]在飲水中添加中藥口服液,發(fā)現(xiàn)能明顯降低冷刺激條件下肉雞心肌組織的損傷,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,提高機(jī)體抗冷應(yīng)激和耐缺氧能力,明顯降低AS的發(fā)生。

      紅三葉(Trifolium pratense)為豆科三葉草屬的多年生草本植物,南北均有種植,資源豐富,是集草、藥兼用于一體的優(yōu)良植物,具有廣闊的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值[6]。紅三葉異黃酮是紅三葉草中重要活性物質(zhì),屬于4′-甲氧基類異黃酮,主要含有4種異黃酮,即芒柄花素(Formononetin)、鷹嘴豆芽素A(Biochanin A)、大豆黃素(Daidzein)、染料木素(Genistein)[7]。流行病學(xué)研究表明,紅三葉異黃酮具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡等作用[8,9],適量應(yīng)用可以降低心血管疾病的發(fā)生概率,其中抗氧化和抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡備受關(guān)注。紅三葉異黃酮對(duì)血紅蛋白-過(guò)氧化氫、黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有明顯抑制作用,還能保護(hù)大腦神經(jīng)元細(xì)胞,有效消除紫外線引起的DNA損傷,被認(rèn)為是有效的抗氧化劑和自由基清除劑[10]。紅三葉異黃酮在肉雞上應(yīng)用具有提高其生長(zhǎng)速度、改善肉質(zhì)的作用[11],但對(duì)AS的影響國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究在肉雞飼料中添加紅三葉異黃酮,分析低溫下對(duì)AS和抗氧化性能的影響,為AS的預(yù)防和治療提供一種新的途徑。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)計(jì)

      2009年1月購(gòu)買300羽1日齡AA雄性肉仔雞,正常飼養(yǎng)至10日齡,隨機(jī)分成對(duì)照組(Ⅰ)、低溫組(Ⅱ)和低溫黃酮組(Ⅲ),每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)15只。Ⅰ組為常溫飼養(yǎng),溫度在(24±2)℃,Ⅱ和Ⅲ組低溫飼養(yǎng),溫度為(12±2)℃,Ⅰ和Ⅱ組飼喂基礎(chǔ)日糧,Ⅲ組飼喂基礎(chǔ)日糧+紅三葉異黃酮(20mg/kg),紅三葉異黃酮購(gòu)于湖南現(xiàn)代九匯有限公司,總黃酮含量80.64%。雞采用籠養(yǎng),自由采食和飲水,第7天進(jìn)行新城疫和傳支二聯(lián)苗免疫。

      1.2 心臟指數(shù)的測(cè)定

      分別于14,21,28,35,42日齡每組隨機(jī)取6只雞,取出心臟,清除脂肪組織和心腔內(nèi)瘀血凝塊,沿冠狀溝剪去心房,稱取全心室(TV)重量,再沿前后縱溝剪下右心室(RV)稱重,最后計(jì)算RV質(zhì)量/TV質(zhì)量×100%,此為心臟指數(shù)(ascites heart index,AHI)。

      1.3 紅細(xì)胞壓積的測(cè)定

      紅細(xì)胞壓積(packed cell volume,PCV)采用溫氏法,用肝素鈉作為抗凝劑,采靜脈血2mL注入試管中,用細(xì)長(zhǎng)的毛細(xì)滴管吸取抗凝血,防止氣泡的產(chǎn)生,緩緩注入溫氏管到刻度100mm處,以3 000r/min的速度離心30 min,讀取紅細(xì)胞層的高度,然后再離心10min至紅細(xì)胞不再下沉為止,此為PCV值。

      1.4 各組肉雞PHS發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)

      肉雞進(jìn)行解剖,在臨床上各器官表現(xiàn)異常,有發(fā)生腹水的肉雞典型特征,其中以肉雞腹腔積液大于10mL為腹水發(fā)生的判定標(biāo)準(zhǔn)之一;并測(cè)定所有肉雞的AHI,AHI>0.25作為腹水發(fā)生的判定的另一標(biāo)準(zhǔn),二者同時(shí)具備作為AS最后判定標(biāo)準(zhǔn)。

      1.5 抗氧化性能的測(cè)定

      肉雞采血分離血清,同時(shí)采肝臟組織,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)測(cè)定所用的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,所用的測(cè)定方法均按照操作說(shuō)明進(jìn)行。

      1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

      采用Excel 2003處理數(shù)據(jù)和DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,以P<0.01(差異極顯著)或P<0.05(差異顯著)為顯著性標(biāo)準(zhǔn),試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞AHI的影響

      肉雞飼喂紅三葉異黃酮能夠減輕AHI,隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),Ⅲ組AHI逐漸增大,但低于Ⅱ組(表1)。在第14和22天,Ⅲ組AHI高于Ⅰ組,低于Ⅱ組,各組間差異不顯著(P>0.05),在第28和35天 Ⅲ組和Ⅰ組均顯著低于Ⅱ組(P<0.05或0.01),42dⅢ組和Ⅰ組低于Ⅱ組,并且各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。

      2.2 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞PCV的影響

      肉雞PCV在第14天,各組間無(wú)明顯差異(P>0.05),在第21和28天Ⅰ組低于Ⅱ組和Ⅲ組,并且顯著低于Ⅱ組(P<0.05),Ⅲ組低于Ⅱ組但無(wú)明顯差異(P>0.05),在35d,Ⅲ組和Ⅰ組均極顯著低于Ⅱ組(P<0.01),在第42天Ⅰ組顯著低于Ⅱ組與Ⅲ組(P<0.05),表明紅三葉異黃酮能夠降低肉雞PCV(表2)。

      表1 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞右心肥大指數(shù)的影響Table 1 Effect of red clover isoflavones on ascites heart index(AHI)of broilers

      表2 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞紅細(xì)胞壓積的影響Table 2 Effect of red clover isoflavones on packed cell volume(PCV)of broilers %

      2.3 紅三葉異黃酮對(duì)低溫肉雞AS發(fā)生率的影響

      Ⅰ組在試驗(yàn)期間肉雞腹水發(fā)生率為1%,Ⅱ組為15%,Ⅲ組為4%,低溫組AS發(fā)病率分別比Ⅰ組和Ⅱ組高14.00和2.75倍,表明紅三葉異黃酮能夠明顯降低AS的發(fā)生率(表3)。

      2.4 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞SOD含量的影響

      肉雞日糧加入紅三葉異黃酮,血清SOD呈先增高后降低的變化(表4),肉雞生長(zhǎng)第14和21天,Ⅲ組和Ⅰ組血清SOD含量顯著低于Ⅱ組(P<0.05),28~35dⅢ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05或0.01),第42天Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05),Ⅲ組高于Ⅱ組但無(wú)明顯差異(P>0.05)。

      肉雞日糧加入紅三葉異黃酮,肝臟SOD呈先增高后降低的變化,第14和21天,Ⅰ肝臟SOD含量顯著低于Ⅱ組(P<0.05),Ⅲ組低于Ⅱ組,但差異不顯著(P>0.05),第28和35天Ⅲ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05),42dⅢ組和Ⅰ組高于Ⅱ組但無(wú)明顯差異(P>0.05)。

      表3 紅三葉異黃酮對(duì)AS發(fā)生率的影響Table 3 Effect of red clover isoflavones on ascites syndrome incidence of broilers %

      表4 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞血清和肝臟SOD含量的影響Table 4 Effect of red clover isoflavones on the content of SOD in serum and liver of broilers U/mL

      2.5 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞GSH-Px含量的影響

      肉雞日糧加入紅三葉異黃酮,血清GSH-Px呈逐漸降低的變化(表5),生長(zhǎng)第14天Ⅲ組和Ⅰ組血清GSHPx含量高于Ⅱ組,并且Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05),21dⅢ組和Ⅰ組高于Ⅱ組,但無(wú)明顯差異(P>0.05),28~42dⅢ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05或0.01)。

      肉雞日糧加入紅三葉異黃酮,肝臟GSH-Px呈逐漸降低的變化,肉雞生長(zhǎng)第14和21天Ⅲ組和Ⅰ組肝臟GSH-Px含量無(wú)明顯差異(P>0.05),28,35,42dⅢ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05或0.01)。

      2.6 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞MDA含量的影響

      肉雞日糧加入紅三葉異黃酮,血清中MDA含量呈增高的變化趨勢(shì)(表6),在肉雞生長(zhǎng)第14和21天,Ⅲ組和Ⅰ組血清MDA含量低于Ⅱ組,并且Ⅰ組顯著低于Ⅱ組(P<0.05或0.01),28~42dⅢ組和Ⅰ組顯著低于Ⅱ組(P<0.05或0.01)。

      肉雞日糧加入紅三葉異黃酮,肝臟中MDA含量呈增高的變化趨勢(shì),肉雞生長(zhǎng)第14天,Ⅲ組和Ⅰ組肝臟MDA含量低于Ⅱ組,并且Ⅰ顯著低于Ⅱ組(P<0.05),21~42dⅢ組和Ⅰ組顯著低于Ⅱ組(P<0.05或0.01),在35,42dⅢ組MDA含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05),其他組之間無(wú)明顯差異。

      表5 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞血清和肝臟GSH-Px含量的影響Table 5 Effect of red clover isoflavones on the content of GSH-Px in serum and liver of broilers U/mL

      表6 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞血清和肝臟MDA含量的影響Table 6 Effect of red clover isoflavones on the content of MDA in serum and liver of broilers nmol/mL

      3 討論

      低溫條件下肉雞的新陳代謝加強(qiáng),對(duì)氧的需要量明顯增加,心臟增加肺部的血流量輸出,血流量的增加導(dǎo)致肺部血管網(wǎng)對(duì)血流的阻力增加,形成肺動(dòng)脈高壓,肺動(dòng)脈壓的升高使右心室后負(fù)荷增加,導(dǎo)致右心功能和結(jié)構(gòu)代償,出現(xiàn)右心肥大,導(dǎo)致心衰[12],最終形成AS。研究表明肉雞AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中血容量增加、紅細(xì)胞變形性降低、血液黏度升高等都與肺動(dòng)脈壓升高密切相關(guān)[13,14]。本試驗(yàn)中加入紅車軸異黃酮,可明顯抑制PCV和AHI,降低環(huán)境低溫下AS發(fā)病率。李曉莉等[15]給慢性缺氧大鼠飼喂染料木黃酮可以預(yù)防右心室肥大發(fā)生,降低AHI。紅三葉異黃酮作為植物雌激素,改善血管的柔順性,調(diào)節(jié)血管細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的合成與釋放,擴(kuò)張血管、增加血管容積改變量,這使得肺動(dòng)脈壓降低,右心負(fù)擔(dān)減輕,防止右心肥大,紅細(xì)胞增生亦受到一定程度的抑制,血液粘稠度降低,減少了環(huán)境低溫下肉雞AS的發(fā)生。缺氧可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平,酪氨酸激酶途徑被激活,植物雌激素為酪氨酸激酶抑制劑,可抑制Ca2+流入和血管收縮,降低肺動(dòng)脈高壓。

      肉雞絕對(duì)缺氧(如高海拔)和相對(duì)缺氧(寒冷和快速增重時(shí)需氧量增加)時(shí),使機(jī)體組織氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化增加,生理水平的活性氧,具有抗炎、抵御外來(lái)病原體的入侵等作用,對(duì)于維持血管正常功能具有積極意義[16]。病理?xiàng)l件下,機(jī)體內(nèi)活性氧的積聚過(guò)多,則會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)組織和細(xì)胞直接造成氧化損傷和(或)啟動(dòng)氧化還原信號(hào)途徑,促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,不能夠合成、釋放血管內(nèi)皮衍生舒張因子等活性物質(zhì),抑制前列環(huán)素(PGI2)合成酶,激活血栓素合成酶,使血栓素A2(TXA2)大量生成,破壞PGI2/TXA2平衡,引起血小板聚集并釋放活性因子,導(dǎo)致血栓形成,血流阻力加大和內(nèi)膜增生,血管舒張受阻,形成肺動(dòng)脈高壓[17]。Enkvetchakul等[2]和楊四軍等[18]認(rèn)為不良條件下肉雞發(fā)生腹水綜合癥時(shí),組織中線粒體內(nèi)源性氧自由基增多,在亞細(xì)胞水平上參與了疾病的病理過(guò)程,是導(dǎo)致AS發(fā)生重要因素。異黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑,羥基能夠?qū)涔┙o脂類化合物自由基,降低了自動(dòng)氧化鏈反應(yīng)的傳遞速度。紅車軸草異黃酮中鷹嘴豆芽素A有2個(gè)羥基,芒柄花素有一個(gè)羥基,具有較強(qiáng)的抗氧化性。SOD和GSH-Px是生物體重要的抗氧化酶,能夠降低氧自由基的積累,減輕氧化損傷[19,20],減少M(fèi)DA的積累。試驗(yàn)中添加紅車軸草異黃酮肉雞血清和肝臟組織中MDA含量低于低溫組,脂質(zhì)過(guò)氧化作用得到減輕。紅車軸草異黃酮抗氧化的另一個(gè)原因,是作用于產(chǎn)生自由基的酶,低溫條件下添加黃酮后,使肉雞血清和肝臟組織中SOD和GSH-Px活性增強(qiáng)。李曉莉等[21]研究證明染料木黃酮可以顯著抑制慢性缺氧小鼠MDA的產(chǎn)生,促進(jìn)一氧化氮的生成,提高SOD活性。向瑞平等[22]研究表明肉雞抗氧化能力增強(qiáng)可降低AS發(fā)病率,低溫加T3誘導(dǎo)的AS,添加抗氧化劑Vc和Ve,肉雞發(fā)病率以及組織中的SOD升高,MDA含量顯著降低。李錦春等[23]限制光照提高了肉雞抗氧化酶活性并減輕體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,減少自由基的產(chǎn)生,減輕以非肌型肺動(dòng)脈肌型化為特征的肺血管重構(gòu)。紅三葉異黃酮能夠降低自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化,減輕對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞的損傷,增強(qiáng)自身的防護(hù)作用。

      本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅三葉異黃酮一定程度上抑制了低溫誘導(dǎo)的AS的影響,提高抗氧化性能,這可能是降低AS發(fā)病率的部分機(jī)制之一,但紅三葉異黃酮與AS之間關(guān)系的更深層次的機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

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      HPLC法同時(shí)測(cè)定天山巖黃芪中4 種異黃酮
      中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
      湖北育成我國(guó)首個(gè)紅三葉品種
      紅三葉聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠宮頸癌U14作用的實(shí)驗(yàn)研究
      中西醫(yī)結(jié)合治療肝硬化腹水30例
      HPLC測(cè)定芪衛(wèi)顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量
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