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    超聲波處理花粉介導(dǎo)‘黃花’梨遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

    2013-08-15 03:26:14馬倩倩宋躍等
    果樹學(xué)報(bào) 2013年4期
    關(guān)鍵詞:黃花梨

    馬倩倩 宋躍等

    摘 要:【目的】建立超聲波處理‘黃花梨花粉介導(dǎo)插入外源基因的技術(shù)體系?!痉椒ā恳浴S花梨花粉為試材,檢測(cè)不同蔗糖溶液中梨花粉破損率;通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)方法,對(duì)超聲波處理功率、處理時(shí)間、間隙時(shí)間、處理次數(shù)4個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化;利用含熒光蛋白基因的表達(dá)載體pCAMBIA 1304檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率?!窘Y(jié)果】梨花粉的適宜等滲溶液為15 g·L-1蔗糖溶液。超聲波處理的梨花粉受體最佳參數(shù)為:超聲波處理功率160~170 W,處理時(shí)間6~7 s,間隙時(shí)間7 s,處理次數(shù)7 次。 采用加入含GFP(green fluorescent protein)基因的pCAMBIA 1304表達(dá)載體質(zhì)粒檢測(cè)優(yōu)化的超聲波處理組合,梨花粉外源基因的插入效率為3%?!窘Y(jié)論】研究確定了超聲波處理‘黃花梨花粉遺傳轉(zhuǎn)化體系。

    關(guān)鍵詞: ‘黃花梨; 花粉介導(dǎo); 超聲波處理; 轉(zhuǎn)化體系; GFP基因

    中圖分類號(hào):S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1009-9980?穴2013?雪04-0537-06

    梨是我國(guó)的第三大果樹樹種,其果實(shí)以爽口多汁、味美多樣、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受消費(fèi)者喜愛。但是,由于梨的雜種苗童期較長(zhǎng),多數(shù)重要性狀受多基因遺傳控制,同時(shí)為克服自交不親和性而長(zhǎng)期進(jìn)行品種間雜交導(dǎo)致的基因組高度雜合等問(wèn)題,使得梨的遺傳改良效率相對(duì)較低,很難滿足現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的要求[1]。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展以及對(duì)果樹基因組學(xué)研究的不斷深入,利用基因工程技術(shù)手段直接對(duì)目標(biāo)農(nóng)藝性狀進(jìn)行定向遺傳改良,成為加速梨品種改良進(jìn)程的一個(gè)重要選擇途徑。

    目前梨上應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因方法主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,該轉(zhuǎn)基因方法比較依賴于組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化體系建立,但不同梨品種之間的誘導(dǎo)再生效率差異較大[2]。例如,在NN69培養(yǎng)基上,‘Seckel品種的再生率為84%,而‘Louise Bonne Panachee僅有42%[3]。Leblay等[4]通過(guò)對(duì)‘Conference及‘Passe-Crassane葉片進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)2者的再生能力相差約50%。還有研究表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)梨的轉(zhuǎn)基因效率很低,Zhu等[5]在西洋梨砧木轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中,在3500張感染的葉片中都沒(méi)有得到再生植株。而且,經(jīng)農(nóng)桿菌侵染梨葉片后不定芽再生率也很低,如‘碭山酥梨的再生率最高僅為19.09%[6],‘豐產(chǎn)梨(Pyrus communis L.)的再生率最高僅為8.1%[7]。因此,十分有必要探索和尋找避免組織培養(yǎng)或植株再生的遺傳轉(zhuǎn)化方法。花粉管通道法是一種在植物上應(yīng)用相對(duì)較多的非組培轉(zhuǎn)基因方法[8],在小麥[9]、水稻[10]和棉花[11-12]都曾成功獲得變異子代。但是其操作難度較大,轉(zhuǎn)化率低,結(jié)果可重復(fù)性差[13],目前較少應(yīng)用。而超聲波處理花粉介導(dǎo)法是經(jīng)改良的花粉管通道法,這種遺傳轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)便、易操作,具有較強(qiáng)的實(shí)用性,不僅在玉米[14]、谷子[15]、花生[16]、野罌粟[17]等物種上成功獲得轉(zhuǎn)基因植株,在多年生果樹如蘋果[18]、葡萄[19]也嘗試建立了相應(yīng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,但在梨樹上的探索和應(yīng)用目前尚未見報(bào)道。因此,我們以‘黃花梨為試驗(yàn)材料,擬通過(guò)對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的花粉及超聲波處理有關(guān)參數(shù)的比較分析,以建立優(yōu)化的梨花粉介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系,從而為該方法在梨轉(zhuǎn)基因上的應(yīng)用提供良好的技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    ‘黃花梨是生產(chǎn)中常用的授粉品種,因此選該品種為試驗(yàn)材料。采集處于大蕾期的‘黃花梨花朵,取花藥部分,在25 ℃干燥環(huán)境中,晾曬至暴出花粉?;ǚ劭芍苯邮褂?,或低溫、干燥條件下保存于干燥硅膠中備用。樣品采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梨種質(zhì)資源圃。

    1.2 梨花粉等滲溶液的篩選

    取適量的‘黃花梨花粉分別懸浮于10、12.5、15、17.5、20、30 g·L-1蔗糖溶液(pH 6.5左右)中,在4 ℃冰箱中靜置0.5 h。取處理后的花粉溶液滴在載玻片上,用×40倍的顯微鏡觀察花粉的破損率(破損花粉包括處于發(fā)生質(zhì)壁分離和細(xì)胞發(fā)生破裂兩種狀態(tài)下的花粉細(xì)胞)。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù),且每次隨機(jī)選取視野,直至觀察到1 000個(gè)花粉細(xì)胞為止,并統(tǒng)計(jì)花粉破損結(jié)果。整個(gè)操作過(guò)程在冰浴條件下進(jìn)行。

    1.3 超聲波處理?xiàng)l件的優(yōu)化

    試驗(yàn)按照四因素五水平(表1)中心組合設(shè)計(jì)的組合進(jìn)行超聲波處理花粉,每次取0.06 g純凈花粉懸浮于3 mL花粉等滲溶液中,依次按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)進(jìn)行超聲波處理,處理過(guò)的花粉沉淀15 min后,用膠頭滴管取底部花粉溶液滴在載玻片上,用×40倍的顯微鏡觀察,每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù),且每次隨機(jī)選取視野,觀察花粉破損率,直至觀察至1 000個(gè)花粉細(xì)胞為止,并統(tǒng)計(jì)花粉破損結(jié)果。破損花粉包括處于發(fā)生質(zhì)壁分離和細(xì)胞發(fā)生破裂2種狀態(tài)的花粉細(xì)胞。整個(gè)操作過(guò)程進(jìn)行冰浴處理。

    1.4 外源質(zhì)粒載體的提取

    選用含有GFP(green fluorescent protein)基因的pCAMBIA 1304 表達(dá)載體質(zhì)粒(由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院楊清教授贈(zèng)予)為外源DNA。從LB固體平板上挑取抗性單克隆菌落接種于1.5 mL 含100 mg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 250 r·min-1震蕩培養(yǎng)5~6 h至飽和,然后將液體全部轉(zhuǎn)入含有20 mL LB液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中,37 ℃ 250 r·min-1震蕩培養(yǎng)8~10 h。取2 mL菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒載體。

    1.5 外源基因插入梨花粉的效率檢測(cè)

    取0.06 g純凈花粉懸浮于3 mL花粉等滲溶液中,按照超聲波處理參數(shù)最佳組合進(jìn)行1次處理,然后加入10 μL 濃度為70 mg·L-1 pCAMBIA 1304表達(dá)載體質(zhì)粒混勻后,重復(fù)進(jìn)行1 次相同超聲波處理,該過(guò)程全部在冰浴條件下進(jìn)行。處理后靜置15 min,倒掉上清,用膠頭滴管吸取沉底的花粉,滴在固體培養(yǎng)基[20] [30 mmol·L-1 MES(2-(4-Morpholino) ethanesulfonic aci),0.01%硼酸,0.03% CaCl2·2H2O,15.0%PEG(聚乙二醇)-4000,10% 蔗糖,pH值在6.5 左右,1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖]上,25 ℃避光條件下,培養(yǎng)2 h,在宏光變倍體式熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司 設(shè)備型號(hào):MVX10)下觀察,用藍(lán)光激發(fā)固體培養(yǎng)基的花粉,以統(tǒng)計(jì)外源基因的轉(zhuǎn)化效率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 花粉等滲溶液的選擇

    2.2 超聲波處理?xiàng)l件的優(yōu)化

    2.3 含GFP基因pCAMBIA 1304表達(dá)載體質(zhì)粒的檢測(cè)

    2.4 以梨花粉為介導(dǎo)的GFP載體轉(zhuǎn)化效率

    用上述篩選的最佳超聲波處理參數(shù)條件,即超聲波處理功率160~170 W、處理時(shí)間6~7 s、間隙時(shí)間7 s、處理次數(shù)7次,對(duì)懸浮于15 g·L-1蔗糖等滲溶液中的梨花粉進(jìn)行1次超聲波處理后,加入pCAMBIA 1 304質(zhì)粒,再進(jìn)行1次相同條件的超聲波處理。處理后取沉底花粉置于固體培養(yǎng)基上,25 ℃避光培養(yǎng)2 h,將載玻片置于體式熒光顯微鏡下,用藍(lán)光激發(fā)觀測(cè)外源基因表達(dá)結(jié)果。由圖版可見,發(fā)綠色熒光的萌發(fā)花粉細(xì)胞即為轉(zhuǎn)化成功的花粉細(xì)胞,觀測(cè)多個(gè)視野中相似花粉細(xì)胞,并統(tǒng)計(jì)外源基因轉(zhuǎn)化‘黃花梨花粉的效率為3%。

    3 討 論

    采用花粉作為轉(zhuǎn)化載體時(shí),花粉細(xì)胞極易在溶液中吸脹破裂而失去活性,而在高濃度溶液中由于反滲作用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重質(zhì)壁分離影響花粉粒在柱頭萌發(fā);因此,必須選擇含一定滲透壓的溶液作為介質(zhì),使外源DNA既能與花粉粒充分接觸,又能維持花粉粒正常的膨壓。蔗糖溶液就是一種既可產(chǎn)生一定滲透壓又不嚴(yán)重影響花粉活力的溶質(zhì),故本試驗(yàn)通過(guò)不同濃度的蔗糖溶液對(duì)比試驗(yàn),確定15 g·L-1蔗糖溶液為梨花粉最佳等滲溶液。這一結(jié)論與梨花粉在蔗糖濃度為15 g·L-1時(shí)花粉萌發(fā)率最高[10]相一致。而玉米和蘋果上分別采用5%、10%蔗糖溶液為超聲波處理等滲溶液[14,18],葡萄上采用25%蔗糖溶液為超聲波處理等滲溶液[19],可見,不同植物花粉粒所需蔗糖等滲溶液濃度是各不相同的。這可能是由于不同植物花粉細(xì)胞中淀粉、蛋白質(zhì)、脂類、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)的含量不同,因此它們的花粉細(xì)胞內(nèi)滲透壓也各不相同。

    在外源基因?qū)牖ǚ哿5倪^(guò)程中,影響超聲波處理結(jié)果的因素有處理功率、處理時(shí)間、處理間隙時(shí)間、處理次數(shù)等。綜合考慮這4個(gè)因素之間可能存在交互作用,本試驗(yàn)利用四因素五水平進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),并篩選出梨花粉最佳超聲波處理參數(shù)為:超聲波處理功率160~170 W、處理時(shí)間6~7 s、間隙時(shí)間7 s、處理次數(shù)7次。從轉(zhuǎn)化機(jī)理方面分析,花粉介導(dǎo)法的關(guān)鍵在于不嚴(yán)重?fù)p傷花粉細(xì)胞,使它能攜帶外源DNA、并隨花粉管生長(zhǎng)順利進(jìn)入胚囊,形成合子,從而直接得到轉(zhuǎn)基因種子[9]。與對(duì)葡萄花粉進(jìn)行超聲波處理相比[19],梨超聲波處理的最佳組合處理強(qiáng)度偏大。因此,也進(jìn)一步說(shuō)明了不同植物的花粉導(dǎo)入外源基因所需要的超聲波處理?xiàng)l件存在差異,均應(yīng)優(yōu)化不同物種適宜的超聲波處理參數(shù),作為前期的技術(shù)保障。同時(shí),本研究還采用報(bào)告基因表達(dá)載體進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化體系的有效性和高效性。GFP基因作為報(bào)告分子和細(xì)胞標(biāo)記最明顯的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需底物或輔因子參與,無(wú)論在活細(xì)胞還是在完整的轉(zhuǎn)基因胚胎和動(dòng)物中,都能有效地監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)移的效率[21]。GUS也常作為報(bào)告基因,但其檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性很高,并且花粉內(nèi)源性GUS會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成嚴(yán)重的干擾[22]。因此,本試驗(yàn)選用GFP作為花粉轉(zhuǎn)基因的報(bào)告基因,在優(yōu)化的超聲波處理參數(shù)條件下,利用GFP基因轉(zhuǎn)入梨花粉的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到3%,相比葡萄的花粉轉(zhuǎn)化效率4‰提高了近10倍[19],從而進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)所篩選的超聲波處理參數(shù)為有效參數(shù),該轉(zhuǎn)化體系可用于目標(biāo)基因?qū)娴倪z傳轉(zhuǎn)化研究。

    綜合以上研究來(lái)看,超聲波處理梨花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法是一種非組培轉(zhuǎn)基因方法,不受基因型、再生能力等因素的制約,與傳統(tǒng)的梨雜交育種相比,僅僅增加了超聲波處理步驟,試驗(yàn)成本低且易操作,易被廣大育種者應(yīng)用到改良梨品種的實(shí)踐中。此外,研究表明,梨的花粉在低溫、干燥的條件下貯藏 1 a后,平均花粉發(fā)芽率仍可達(dá)到73.8%,無(wú)明顯下降[23]。因此,我們不僅可利用梨的新鮮花粉為受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,也可以使用經(jīng)過(guò)保存仍具有良好萌發(fā)率的貯藏花粉為受體,從而解決花期不遇的問(wèn)題。因此,本研究建立的超聲波處理介導(dǎo)花粉轉(zhuǎn)基因方法對(duì)于梨的定向遺傳改良具有重要的理論和實(shí)踐意義。(本文圖版見封2)

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