利用Solexa測(cè)序技術(shù)鑒定甜橙miRNAs

王永江　李中安等

摘 要：【目的】預(yù)測(cè)鑒定甜橙miRNA及其作用機(jī)制和功能，為深入研究挖掘甜橙miRNA及其抗病相關(guān)miRNA的作用等提供翔實(shí)的基因信息。【方法】利用高通量測(cè)序技術(shù)、相關(guān)的生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建甜橙小RNA文庫(kù)，然后以甜橙基因組為參考基因組，進(jìn)行甜橙miRNA鑒定和靶基因預(yù)測(cè)；利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能分析?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建了甜橙小RNA文庫(kù)：獲得12 617 944條小RNA序列分屬于3 065 625種小RNA序列，獲得序列中24 nt長(zhǎng)的序列最多，占到序列的49.3%。鑒定出2 199 561條miRNA，其中已知miRNA638 722條，分屬52種miRNA家族，候選miRNA1 560 839條，分屬204種miRNA。已知的52種保守miRNA基因預(yù)測(cè)出927個(gè)靶基因位點(diǎn)，候選miRNA中有154種預(yù)測(cè)出1 777個(gè)靶基因位點(diǎn)。GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因分類顯示，甜橙miRNA調(diào)控的靶基因主要參與多細(xì)胞互作、轉(zhuǎn)錄本調(diào)控和細(xì)胞組成等生物學(xué)途經(jīng)和分子功能方面。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中病原物與寄主互作亞庫(kù)分析結(jié)果顯示，靶基因主要與抗性蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和抗病酶等關(guān)聯(lián)。【結(jié)論】預(yù)測(cè)鑒定出一批甜橙miRNA及其調(diào)控的靶基因，為進(jìn)一步研究提供了參考信息。

關(guān)鍵詞： 甜橙； miRNA； 靶基因； 高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S666.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0526-11

甜橙是柑橘中栽培最多的一類品種，其種植面積占到柑橘總量的60%以上，對(duì)其研究具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類大小約為22 nt的內(nèi)源小分子RNA，其主要由莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生，其在基因表達(dá)、基因組表觀遺傳修飾和抗病毒等方面起著重要的調(diào)控作用[1-5]。

隨著第二代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，大量利用新一代測(cè)序技術(shù)研究miRNA的試驗(yàn)被報(bào)道[6-13]。在柑橘miRNA的研究中，前人[11-13]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)參考柑橘EST序列對(duì)枳中的miRNA進(jìn)行研究鑒定；Xu等[10]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究野生柑橘品種和普通品種間胡蘿卜素合成相關(guān)的miRNA；Wu等[14]對(duì)茯苓甜橙體細(xì)胞胚胎發(fā)育期的特異miRNA進(jìn)行研究，鑒定出與胚細(xì)胞發(fā)育調(diào)控緊密相關(guān)的10個(gè)miRNA；陳曉東[15]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)椪柑試管苗葉片中的miRNA進(jìn)行鑒定，并對(duì)其進(jìn)行分類注釋，鑒定出一批miRNA。前期由于甜橙全基因組還沒(méi)有被公布，研究者們以柑橘的ESTs序列為參考基因進(jìn)行miRNA的預(yù)測(cè)鑒定[11-13]。2011年初甜橙 （Citrus sinensis）全基因組的首次公布為深入研究甜橙的基因功能提供了一個(gè)有力的平臺(tái)，但還未見(jiàn)利用甜橙全基因組為參考基因組，深入全面的挖掘甜橙（C. sinensis）實(shí)生苗miRNA的報(bào)道，因此以甜橙全基因組作為參考基因組采用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)研究甜橙miRNA具有重要的意義。我們的目的是挖掘出甜橙miRNA并預(yù)測(cè)其靶標(biāo)位點(diǎn)，為深入研究甜橙miRNA的功能和作用機(jī)制等提供具有針對(duì)性的參考信息。

1 材料和方法

1.1 植物材料

選取2 a生西蒙斯甜橙（Citrus sinensis）實(shí)生苗5株，采摘其頂端嫩葉等量混合后提取總RNA，目的使提取西蒙斯甜橙的葉片RNA具有一定的代表性。該材料由國(guó)家柑橘苗木脫毒中心提供。

1.2 試劑

Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，水飽和酚、氯仿、異戊醇、溴化乙錠（EB）、DEPC、瓊脂糖等購(gòu)自鼎國(guó)生物工程公司。核酸外切酶Ⅰ購(gòu)自上海生工生物有限公司。

1.3 儀器

1.5 文庫(kù)構(gòu)建及其數(shù)據(jù)分析

1.6 保守miRNA的鑒定

利用miRBase（18.0）和NCBI相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出保守的miRNA。保守miRNA的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：（1）測(cè)序序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的保守序列匹配堿基數(shù)不少于16個(gè)堿基。（2）全序列錯(cuò)配堿基數(shù)不多于3個(gè)堿基。（3）空缺不超過(guò)2個(gè)堿基等。（4）存在莖環(huán)的前體二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)鑒定出的保守miRNA進(jìn)行首位堿基、序列位點(diǎn)堿基偏好性分析。

1.7 候選miRNA的預(yù)測(cè)鑒定

利用軟件Mireap預(yù)測(cè)甜橙候選miRNA （novel-miRNA）。Mireap軟件由華大基因公司開(kāi)發(fā)，該軟件根據(jù)miRNA前體的標(biāo)志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)、前體物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、剪切子（Dicer）酶切位點(diǎn)信息、能量值等條件預(yù)測(cè)鑒定候選miRNA，具體條件參照前人[8，16-17]已報(bào)道的條件。（1）miRNA前體能折疊為發(fā)夾型二級(jí)結(jié)構(gòu)。（2）成熟miRNA的候選序列位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一條臂上，而對(duì)應(yīng)的miRNA*位于另一條臂上。（3）成熟miRNA和miRNA*的非匹配堿基數(shù)不能超過(guò)6個(gè)，miRNA*區(qū)不能形成發(fā)夾環(huán)。（4）預(yù)測(cè)的miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能小于-18 kcal·mol-1。（5）miRNA中（A+U）含量必須在30%～70%。

1.8 miRNA靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)

利用Mireap軟件對(duì)預(yù)測(cè)出的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。參照Allen等[18]和Schwab等[19]方法。其標(biāo)準(zhǔn)為：（1）miRNA和靶靶標(biāo)基因復(fù)合體間相鄰位點(diǎn)的堿基錯(cuò)配數(shù)小于等于2個(gè)堿基。（2）miRNA和靶標(biāo)基因間不得超過(guò)4個(gè)的錯(cuò)配（G-U為0.5個(gè)錯(cuò)配）。（3）miRNA和靶標(biāo)基因復(fù)合體間，miRNA的5′端開(kāi)始第2～12個(gè)位點(diǎn)錯(cuò)配堿基位點(diǎn)不得相鄰。（4）miRNA和靶標(biāo)基因復(fù)合體的第10～11個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有錯(cuò)配堿基。（5）在miRNA和靶標(biāo)基因復(fù)合體間，miRNA5′端起第1～12個(gè)位點(diǎn)堿基錯(cuò)配數(shù)小于等于2.5（G-U為0.5個(gè)錯(cuò)配）。（6）miRNA和靶標(biāo)基因復(fù)合體的最低自由能應(yīng)大于等于miRNA與靶標(biāo)基因最佳互補(bǔ)體時(shí)最低自由能的75%。

1.9 GO富集分析

1.10 KEGG通路分析

利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp/kegg）進(jìn)行靶基因調(diào)控代謝通路分析。對(duì)映射比對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性富集，尋找與整個(gè)參考基因相比較在候選靶基因中顯著性富集的通路，預(yù)測(cè)靶基因參與的調(diào)控代謝路徑，篩選出參與病害互作通路的靶基因及相關(guān)的miRNA，為進(jìn)一步研究甜橙抗病基因提供針對(duì)性的基因信息。富集分析計(jì)算公式同公式（1）。

其中N為所有基因中具有通路注釋的基因數(shù)目；n為N中的候選靶基因的數(shù)目；M為所有基因中注釋為某特定通路的基因數(shù)目；m為注釋為該特定通路的候選靶基因數(shù)目。概率P≤0.01的通路認(rèn)為顯著關(guān)聯(lián)，即靶基因參與代謝通路的調(diào)控。

1.11 miRNA的液相雜交驗(yàn)證

選取部分小RNA進(jìn)行熒光素探針標(biāo)記，隨后進(jìn)行液相Northern雜交，方法參照Wang等[20]已報(bào)道的方法，其主要步驟有：（1）小RNA的提取分離；（2）核酸變性；（3）雜交，在低于每個(gè)探針Tm值10 ℃的溫度下進(jìn)行雜交2 h以上；（4）酶切，雜交后的反應(yīng)溶液中添加核酸外切酶I進(jìn)行酶切反應(yīng)，37 ℃ 2 h，80 ℃ 10 min；陰性對(duì)照為探針直接進(jìn)行酶切；（5）電泳分離，酶切產(chǎn)物進(jìn)行PAGE膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 文庫(kù)構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析

2.2 保守miRNA鑒定分析

鑒定結(jié)果顯示，638 720條序列分屬927種堿基序列類型，該927種序列類型比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)（miRBase18.0）中55個(gè)家族，其中數(shù)據(jù)庫(kù)中的4個(gè)miRNA*也在測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到。

2.3 候選miRNA的鑒定分析

2.4 靶基因預(yù)測(cè)分析

保守miRNA的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示，52種保守miRNA基因型預(yù)測(cè)到927個(gè)靶基因位點(diǎn)。其中，一個(gè)miRNA調(diào)控一個(gè)靶基因的miRNA有3個(gè)，一個(gè)miRNA調(diào)控2個(gè)或2個(gè)以上靶基因的miRNA有49個(gè)，如csi-miR156miRNA可調(diào)控63個(gè)靶基因位點(diǎn)。

miRNA豐富的靶基因信息為進(jìn)一步靶基因功能預(yù)測(cè)分析奠定基礎(chǔ)，為篩選與病害互作相關(guān)的基因提供了豐富的基因信息。

2.5 GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

結(jié)果顯示甜橙中保守miRNAs的927個(gè)靶基因和候選miRNAs的1 777個(gè)靶基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中與分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組成3個(gè)亞庫(kù)中都有關(guān)聯(lián)，但其中最多的涉及生物過(guò)程（biological process ontology）和分子功能（the molecular function ontology），而與細(xì)胞組分（cellular component ontology）關(guān)聯(lián)較少。與biological process亞庫(kù)映射顯著性關(guān)聯(lián)的有66項(xiàng)，關(guān)聯(lián)富集顯著的前三個(gè)項(xiàng)分別為multicellular organismal process，其P值為6.64e-26，有2 192個(gè)基因映射關(guān)聯(lián)； multicellular organismal development，其P值為7.34e-24，有1 924個(gè)基因映射關(guān)聯(lián)； Transcription，其P值為1.05e-21，有1 306個(gè)靶基因映射關(guān)聯(lián)。與molecular function顯著關(guān)聯(lián)的有12項(xiàng)，主要有核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄本因子的激活、氧化還原酶的激活、核酸結(jié)合等。在細(xì)胞組分的生物本論項(xiàng)中，有2項(xiàng)映射顯著關(guān)聯(lián)，分別為轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（transcription factor complex）和核質(zhì)（nucleoplasm）。

miRNA功能主要為信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控靶基因表達(dá)等。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miRNA的靶基因主要與生物過(guò)程中的多細(xì)胞互作等項(xiàng)顯著關(guān)聯(lián)，結(jié)果與miRNA已報(bào)道的參與信號(hào)傳導(dǎo)等功能相符。

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，靶基因最顯著關(guān)聯(lián)項(xiàng)為病原物與寄主互作代謝通路，其P值為4.14e-26，KO號(hào)04626。miRNA的靶基因主要與抗性蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、受體酶等相關(guān)聯(lián)。保守miRNA中，有143個(gè)靶基因與該數(shù)據(jù)高度相關(guān)聯(lián)，這143個(gè)靶基因中主要受miR172、miR390、miR472、miR396c和miR482a等的miRNA調(diào)控。關(guān)聯(lián)靶基因最多的為RPS2抗病蛋白，有133個(gè)靶基因與其顯著相關(guān)，其次為RPM1抗病蛋白，有93個(gè)靶基因相關(guān)。在保守miRNA靶基因相關(guān)聯(lián)的RPM1中的48個(gè)靶基因中，有5個(gè)是miR396c的靶基因、23個(gè)miR472的靶基因、20個(gè)miR482的靶基因。與RPS2相關(guān)聯(lián)的39個(gè)靶基因中，有1個(gè)為miR396c的靶基因、11個(gè)miR472的靶基因、16個(gè)miR482a的靶基因、11個(gè)miR482b的靶基因（表3）。

2.6 miRNA 液相雜交

結(jié)果顯示，陰性對(duì)照沒(méi)有印跡，陽(yáng)性對(duì)照和樣品的雜交探針的印跡清晰（圖版-H）。雜交結(jié)果進(jìn)一步增強(qiáng)了甜橙miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果的真實(shí)性和深度測(cè)序獲得的miRNA的準(zhǔn)確性。

3 討 論

利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)鑒定miRNA，是當(dāng)今發(fā)現(xiàn)和研究植物小RNA的一條重要途徑。HiSeq2000測(cè)序儀由Illumina公司根據(jù)Solexa技術(shù)開(kāi)發(fā)的第2代高通量測(cè)序儀器。該測(cè)序儀采用邊合成邊測(cè)序技術(shù)，減少因二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失；一次性可獲得數(shù)百萬(wàn)小RNA序列，能夠快速全面地鑒定該物種在該狀態(tài)下的微小RNA并能發(fā)現(xiàn)新的微小RNA；另外所測(cè)得的小RNA幾乎涵蓋所有RNA，是目前研究小RNA主要測(cè)序儀器之一[21]。

本實(shí)驗(yàn)在鑒定保守miRNA時(shí)，鑒定到了數(shù)據(jù)庫(kù)中4種miRNA*，由于miRNA*極易降解，在生物體內(nèi)存在量不及miRNA的百分之一，能鑒定出miRNA*說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的小RNA文庫(kù)信息量豐富完整。同時(shí)，鑒定的保守和候選miRNA的成熟序列具有一般miRNA的5′端首位堿基偏“U”對(duì)“G”有抗性，第2～4位堿基缺“U”等普遍特性。前體物預(yù)測(cè)中，本研究預(yù)測(cè)miRNA前體物在62～362 nt與前人預(yù)測(cè)植物miRNA的前體物大小范圍一致。以上這些結(jié)果進(jìn)一步增強(qiáng)了結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，同時(shí)也說(shuō)明甜橙miRNA的前體物具有豐富的多樣性。

本研究測(cè)序獲得的小RNA序列中，24 nt的小RNA為主，占到總數(shù)的49.03%，這與陳曉東等[15]利用深度測(cè)序技術(shù)研究椪柑miRNA時(shí)，所測(cè)得序列以24 nt的序列最多占總條數(shù)的48.66%研究結(jié)果一致。說(shuō)明結(jié)果具有一定的代表性，同時(shí)也增強(qiáng)了該結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，在多數(shù)植物中也存在同樣現(xiàn)象，如莧菜試管苗[39]、擬南芥種子[40]等也是24 nt的reads最多，然而，有少數(shù)被子植物中以21 nt小RNA作為主要形式，如西紅柿[6]、楊樹(shù)（Populus）[41]、小麥（Triticum aestivum）[42]等。植物中不同DCL酶作用產(chǎn)生不同的大小的小RNA，DCL4酶作用產(chǎn)生21 nt的小RNA而DCL3酶產(chǎn)生24 nt大小的小RNA[2，4-5]；由此可推測(cè)甜橙植株內(nèi)，小RNA的產(chǎn)生主要受DCL3酶作用。

對(duì)miRNA的靶基因KEGG的病原物與寄主通路分析顯示，miRNA調(diào)控的靶基因有大量與病原物與寄主互作通路相關(guān)聯(lián)，說(shuō)明miRNA參與了病原物與寄主互作途徑，為進(jìn)一步研究甜橙抗感機(jī)制和基因提供了參考；同時(shí)也為研究甜橙miRNA在甜橙與病害互作用中的作用提供了思路和基因信息。在關(guān)聯(lián)的靶基因與其對(duì)應(yīng)調(diào)控的miRNA中，有些miRNA有多個(gè)靶基因，且多個(gè)miRNA的多個(gè)靶基因共同調(diào)控一個(gè)因子。如保守的miR472、miR390、miR396和候選的novel-m015等都具有多個(gè)靶基因，而這些靶基因同時(shí)調(diào)控一個(gè)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)，也存有一個(gè)miRNA的多個(gè)靶基因參與多個(gè)蛋白或酶的調(diào)控，如mi-R472和miR482的靶基因分別與RPM1、RPS2、RPS5等關(guān)聯(lián)。這些關(guān)系的復(fù)雜性，為研究miRNA在病害與寄主互作中的作用提供了思路，同時(shí)也增加了研究的復(fù)雜性。

miRNA作為一個(gè)非常重要而且在飛速發(fā)展的研究領(lǐng)域，小RNA的形成機(jī)制與作用機(jī)理還有很多謎團(tuán)有待進(jìn)一步的挖掘探索。實(shí)驗(yàn)獲得甜橙實(shí)生苗miRNA為進(jìn)一步研究甜橙特異環(huán)境下特異miRNA提供了參考信息。甜橙特異環(huán)境條件下miRNA表達(dá)及其作用、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的生物學(xué)驗(yàn)證、關(guān)鍵miRNA的功能與作用途徑等還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)鑒定出一批miRNA，并預(yù)測(cè)篩選出一批調(diào)控的靶基因與植物與病原物互作中高度相關(guān)的miRNA。為甜橙抗病基因的挖掘以及病原物互作信號(hào)傳導(dǎo)等研究提供參考信息，為進(jìn)一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)。（本文圖版見(jiàn)插1）

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