脂肪酶的酯合成活性檢測方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展

徐曉勇，鄢洪德，孟慶梅，張 群

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.杭州生物醫(yī)藥科技創(chuàng)業(yè)園有限公司，浙江 杭州 310053）

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3），全稱為甘油三酰酯水解酶，它可以催化水解甘油酯產(chǎn)生甘油、甘油單雙酯和脂肪酸。目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、皮革、化妝品、生物柴油、醫(yī)療醫(yī)藥和洗滌劑等多個(gè)工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。隨著技術(shù)的發(fā)展與革新，脂肪酶在非水相中的應(yīng)用越來越廣泛，也受到越來越多研究者的重視。目前脂肪酶主要在非水相中進(jìn)行酯合成、酯化拆分和轉(zhuǎn)酯化拆分等反應(yīng)。此時(shí)，利用傳統(tǒng)方法篩選到的脂肪酶可能并不適用于非水相中的催化反應(yīng)。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的篩選方法，是檢測脂肪酶在水相中的水解活力，在實(shí)際應(yīng)用中由于反應(yīng)體系的改變，脂肪酶可能表現(xiàn)出較低的酶活力，這與篩選過程中的酶活力不一致。究其原因，是由于在非水相中，酶的構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致酶的催化性能也發(fā)生變化。

為克服由于反應(yīng)體系的變化導(dǎo)致的酶活力不一致的問題，一些研究者試圖建立一種快速、方便的方法來篩選具有酯合成活力的脂肪酶，并進(jìn)行合成活力的測定。由于脂肪酶催化底物的多樣性，因此研究者需要根據(jù)脂肪酶在非水相中不同的應(yīng)用范圍，探索不同的酯合成活力脂肪酶的篩選和檢測方法。筆者基于脂肪酶的酯合成活性檢測方法的重要性這個(gè)事實(shí)，對(duì)非水相中脂肪酶的酯合成活性檢測方法進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)目前脂肪酶在非水相體系中的應(yīng)用情況也進(jìn)行了簡要介紹。

1 脂肪酶的酯合成活性檢測方法

目前用于酯合成的檢測方法主要有：（1）滴定法；（2）平板檢測法；（3）吸光度檢測法；（4）氣相色譜檢測法；（5）微量滴定板法。

1.1 滴定法

目前在產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選過程中，在對(duì)脂肪酶的酯合成能力進(jìn)行測定時(shí)，滴定法是經(jīng)常被用到的。滴定法的原理是：在非水相介質(zhì)中，脂肪酶催化酸和醇合成酯，然后通過對(duì)反應(yīng)體系中剩余的酸含量進(jìn)行滴定，測定脂肪酶的酯合成活性。酯合成活力主要以反應(yīng)體系中的酸的減少量來定義。滴定法中涉及到一個(gè)指示劑的選擇問題，下面將從指示劑角度具體來講滴定法。

1.1.1 酚酞指示劑

酚酞又稱菲諾夫他林，是一種弱的有機(jī)酸，其變色范圍為 pH=8.2（無色）～9.8（紅色），一般認(rèn)為酚酞在稀酸或中性溶液里為無色的內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)，當(dāng)pH＞8.2時(shí)為紅色的醌式結(jié)構(gòu)[1]。因此常被用于酸堿滴定中作為堿的專用指示劑。

而羅星[2]研究脂肪酶在非水相中合成硬脂酸月桂醇酯時(shí)，在正己烷、正辛醇以及正辛酸的非水相介質(zhì)中，加入脂肪酶并在40℃的水浴中進(jìn)行酯和成反應(yīng)一段時(shí)間，以不加酶作為空白對(duì)照。反應(yīng)后以酚酞作為指示劑，用0.025 mol/L的NaOH進(jìn)行滴定，記錄空白和樣品消耗堿的量，并將一個(gè)酯合成活力單位定義為每分鐘脂肪酸減少的摩爾數(shù)與加酶量的比值。而顏興和[3]等人在對(duì)華根霉脂肪酶進(jìn)行有機(jī)合成的研究時(shí)，對(duì)合成酶活力的定義是每分鐘消耗1 μmol己酸的酶量定義為一個(gè)合成酶活單位，這與羅星的通過比值定義合成酶活是不同的。徐巖[4]、Kiran[5]等人在酯合成活力定義時(shí)是在反應(yīng)后的體系中，以酚酞作為指示劑，用氫氧化鈉滴定反應(yīng)體系中剩余的酸來計(jì)算脂肪酶的酯合成酶活。

1.1.2 百里酚藍(lán)指示劑

百里酚藍(lán)是一種棕綠色結(jié)晶性粉末，有異臭，溶于乙醇呈黃色，溶于稀堿液呈藍(lán)色，不溶于水。作為酸堿指示劑的時(shí)候，其變色范圍為pH1.2(紅)～2.8(黃)，8.0(黃)～9.6(藍(lán))。而用百里酚藍(lán)做指示劑，因?yàn)榈味ńK點(diǎn)的顏色更容易判定，減少了滴定中的誤差范圍。

Yun Teng[6]等人以脂肪酶催化棕櫚酸和乙醇合成棕櫚酸乙酯的反應(yīng)中，則以含有甲醇的百里酚藍(lán)為指示劑，用氫氧化鉀-甲醇溶液進(jìn)行滴定，并以每分鐘消耗1μmol棕櫚酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。在該方法中，利用含有甲醇的百里酚藍(lán)做指示劑，可以防止在滴定過程中渾濁現(xiàn)象的發(fā)生，是滴定體系保持一個(gè)均一的單相體系[7]。

滴定法中涉及到的兩種指示劑，都具有一定的適用性，但是相比較而言，用百里酚藍(lán)做指示劑具有準(zhǔn)確性更高、認(rèn)為產(chǎn)生的誤差更小的優(yōu)點(diǎn)。利用滴定法測定酯合成活力的方法，具有簡單、方便、易于在實(shí)驗(yàn)室條件下操作。但它也存在一定的缺陷性，因?yàn)槔玫味ǚㄟM(jìn)行操作，是通過酸的減少量或者剩余量來定義酶活的，因此對(duì)滴定過程中的操作規(guī)范性要求比較高，而且還是存在一些人為的誤差是無法避免的。

1.2 吸光度法

吸光度法的原理是利用底物與酶作用后，生成的產(chǎn)物具有一定的特色基團(tuán)，表現(xiàn)出某種特定的肉眼可以觀察到的顏色[8]，顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與產(chǎn)物的濃度有關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到某種吸光值下的產(chǎn)物的量。

騰云[9]在對(duì)硝基苯棕櫚酸酯（pNPP）的正庚烷溶液中，加入酶和無水乙醇進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束用氫氧化鈉萃取對(duì)硝基苯酚（pNP），并在410 nm下測吸光度。然后根據(jù)pNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出生成的pNP的量，將每分鐘生成1 μmol pNP的量定義為一個(gè)酯合成酶活力單位。其測定原理是在有機(jī)相中脂肪酶催化pNPP和與乙醇之間的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，通過測定吸光度以確定對(duì)硝基苯酚的生成量，從而測定合成酶活。但是這種方法在反應(yīng)體系中的產(chǎn)物進(jìn)行萃取，因此加大了操作的工作量，降低了檢測效率。

而Amaya[10]等人用脂肪酶在正己烷體系中，催化辛醇和亞油酸的酯合成反應(yīng)，反應(yīng)后加入硅膠吸附反應(yīng)體系中剩余的亞油酸后，在235 nm下測定吸光度測定脂肪酶的合成活性。該方法相對(duì)于騰云的方法，減少了萃取這一步驟，并且通過硅膠吸附掉體系中剩余的亞油酸，耗時(shí)更短，也更快捷方便。但是該方法利用的硅膠吸附剩余的酸的方法不具有普遍適用性，因此使用受到一定的限制。

1.3 氣相色譜檢測法

氣相色譜法作為近幾年用的比較多的一種檢測手段，只需少量的樣品就可以檢測到，而且靈敏度高，應(yīng)用范圍也較廣。在脂肪酶的酯合成活力的檢測中，是利用醇和酸，在酶的催化下合成酯。然后通過氣相色譜，檢測生成的酯的含量來定義酶活的。

孫舒楊[11]以辛酸和乙醇為反應(yīng)底物，在脂肪酶的催化下，40℃，150 r/min反應(yīng)30分鐘。然后離心取上清，加入2-己醇作為內(nèi)標(biāo)，混勻后進(jìn)行氣相色譜檢測反應(yīng)后反應(yīng)液中的辛酸乙酯的含量。通過該方法可以定量的檢測得到合成的酯，對(duì)結(jié)果的指示更為準(zhǔn)確。Gandolfi[12]在5 mL的反應(yīng)體系中，乙醇和酸按照 1∶1 的比例加入（1 g/L）,然后加入凍干的菌體（20 g/L）,在振蕩水浴中反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束通過氣相色譜進(jìn)行檢測酯的合成含量。Kristensen[13]等人以丙醇和月桂酸為底物，在酶催化下進(jìn)行酯合成，并通過氣相檢測月桂酸和丙酯的含量。由于氣相色譜法靈敏度高，因此在酯合成活性的檢測中應(yīng)用得較多。但用該方法，樣品在進(jìn)樣之前需要經(jīng)過萃取、旋蒸等一些步驟。而這需要借助一些有機(jī)試劑，增加了檢測成本。

1.4 平板檢測法

在進(jìn)行大量篩選具有酯合成活性的脂肪酶的時(shí)候，為了減少工作量，提高篩選的效率，一些研究者利用了平板快速檢測法。該方法是通過酶在含有底物的顯色平板上進(jìn)行反應(yīng)，變色圈來表征酯合成活性的大小。

Sondoval[14]等人將菌株在含有酯合成底物（乙醇和不同的酸）的羅丹明顯色平板上進(jìn)行培養(yǎng)，具有酯合成活性的菌株由于合成了酯，因此在紫外下其酯合成位置的熒光會(huì)消失，從而在羅丹明的顯色平板可以看到一個(gè)黑暗的光圈。通過這種方法，直觀地顯示了脂肪酶的酯合成活性的有無，以及合成活性的大小。通常在初次運(yùn)用該方法的時(shí)候，需要切膠，溶解并通過高效液相色譜（HPLC）檢測合成的是否是酯。

1.5 微量滴定板法

前面綜述的幾種方法在目前的酯合成菌株的篩選及應(yīng)用過程中，使用的比較多。目前還有一種利用在滴定板上操作，通過檢測具有熒光強(qiáng)度的產(chǎn)物來測定的。

Konarzycka-Bessler[15]等人利用一種微量滴定板法，該方法的基本原理如下：利用脂肪酶在有機(jī)溶劑中，作用于月桂酸乙烯酯和乙醇之間的反應(yīng)。在該反應(yīng)中，酮烯醇互變異構(gòu)化釋放出的醛與肼生成具有強(qiáng)熒光的肼衍生物，并通過熒光強(qiáng)度表征生成的酯含量。

在該方法中，只需要0.01～0.02 mg左右的酶，以及分別15 μmol的月桂酸乙烯酯和丙醇即可進(jìn)行檢測。但是也有一定的缺陷性，該方法需要專業(yè)性的熒光檢測儀器以及相關(guān)的試劑，因此比較昂貴，難以普及。

2 脂肪酶的應(yīng)用研究進(jìn)展

由于人們對(duì)醫(yī)藥、環(huán)境、食品等方面的關(guān)注和安全意識(shí)的增強(qiáng)，利用生物手段以獲得人們需要的產(chǎn)品受到越來越多人的青睞。因?yàn)樯锩阜ù呋且环N綠色環(huán)保的合成工藝，具有專一性強(qiáng)、速率快，條件溫和，對(duì)環(huán)境污染少等特點(diǎn)。而脂肪酶由于特殊的油-水界面催化特性，較高的有機(jī)溶劑耐受性，在醫(yī)藥，食品、環(huán)境等相關(guān)領(lǐng)域受到越來越多的重視。

2.1 在食品添加劑中的應(yīng)用

目前在食品行業(yè)用維生素類作為抗氧化劑，但是由于其性質(zhì)不穩(wěn)定，常用維生素酯進(jìn)行替代。而在維生素酯中尤其以合成L-抗壞血酸酯為主，因?yàn)槠渚哂袩o毒、易于被消化吸收的特點(diǎn)。姜新慧[16]等人以L-抗壞血酸和棕櫚酸為底物，用洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶在叔丁醇中催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯。經(jīng)過條溫度、加酶量、時(shí)間等參數(shù)的優(yōu)化，最終的產(chǎn)率達(dá)到89.5%。李紅[17]等人則以NOVOZYME435、LIPOLASE和TLIM三種脂肪酶做催化劑進(jìn)行比較，在叔戊醇中合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)以NOVOZYME435脂肪酶作為催化劑，3 mL反應(yīng)體系中酶用量為0.05 g，加入0.3 g的四丁基溴化銨作為相轉(zhuǎn)移劑時(shí)，得到的產(chǎn)物濃度為16.6 mg/mL。

乙酸正己酯因?yàn)槠洫?dú)特的水果香，被當(dāng)作食用香精用于食品行業(yè)中。楊本宏[18]等人以徳氏根霉菌脂肪酶為催化劑，在三氯乙烷、環(huán)己烷、正己烷、正庚烷、異辛烷五種不同的有機(jī)溶劑中，催化底物乙酸和正己醇合成乙酸正己酯，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以疏水性大的正庚烷為溶劑時(shí)，70℃反應(yīng)5 h后，轉(zhuǎn)化率達(dá)88%。

2.2 在醫(yī)藥化工中的應(yīng)用

糖脂作為一種表面活性劑，已經(jīng)被用于醫(yī)藥、化工等多種行業(yè)。Ferrer[19]等人以Thermomyces lanuginosus和Candida antarctica B脂肪酶為催化劑，在二甲基-二丁醇中利用脂肪酸乙烯酯的糖酯化合成糖脂，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物6-O-葡萄糖月桂酸酯在6 h之后轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%，產(chǎn)率可以達(dá)到90%以上。

布洛芬是一種治療效果很好的抗炎藥，作用機(jī)理是抑制前列腺素的合成從而達(dá)到治療的效果。但是其S型對(duì)映體的療效是R型的160倍，因此往往只需少量純的S型布洛芬對(duì)映體就可以達(dá)到預(yù)期的理想治療效果[20]。Marszall[21]等人把商業(yè)脂肪酶CRL和OF固定到處理過的磁性顆粒載體上，在環(huán)己烷中加入外消旋的布洛芬，以丙醇作為酰基受體進(jìn)行拆分。其中OF脂肪酶表現(xiàn)出很好的拆分效果，其中動(dòng)力學(xué)拆分（R，S）—布洛芬的對(duì)映體選擇性（E）為19，產(chǎn)物的對(duì)映體過量值（e.e.p）為 83%，轉(zhuǎn)化率為 42%。

1-苯乙醇的手性中間體可用于合成手性藥物，而(S)-1-苯乙醇是一種重要的農(nóng)藥中間體。范衛(wèi)東[20]以 rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯為底物，用Candida lipolytica脂肪酶進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化拆分得到(S)-1-苯乙醇，并對(duì)拆分條件進(jìn)行優(yōu)化，轉(zhuǎn)化率和e.e.p分別由原先的15.97%和19.00%上升到49.88%和99.53%。

單一的手性2-辛醇是合成生物殺蟲劑的一種重要中間體。戴大章[21]用Ultrastable-Y分子篩固定擴(kuò)展青霉脂肪酶，在50℃下對(duì)外消旋的2-辛醇進(jìn)行手性拆分，反應(yīng)24 h之后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.68%，對(duì)映體過量值（e.e）為 98.75%，對(duì)映體選擇性平均達(dá)到460以上。

2.3 在環(huán)保材料中的應(yīng)用

由于現(xiàn)在對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)加強(qiáng)，研究者們也在尋找一種綠色的工業(yè)產(chǎn)品以滿足市場的需求。利用脂肪酶合成具有可降解特性的產(chǎn)品以替代目前一些不可被降解的，對(duì)環(huán)境危害大的產(chǎn)品。目前研究的較多的是利用脂肪酶催化合成具有降解特性的高分子聚酯材料。

楊金明[22]利用脂肪酶N435作為催化劑合成直鏈聚酯，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)用長鏈的二酯和醇進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，容易聚合形成直鏈的聚酯。而在反應(yīng)體系中加入甘油進(jìn)行共聚反應(yīng)，可獲

得更大分子量的聚酯。Numata[23]以2,2-雙(羥甲基)-1,3-丙二醇和環(huán)己六醇作為聚酯合成的引發(fā)劑，最終合成了具有分支結(jié)構(gòu)的聚乳酯，該結(jié)構(gòu)的聚酯具有更強(qiáng)的降解能力，因此存在比較大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)語與展望

在具有酯合成活性的脂肪酶篩選過程中，尋找一種合適快速的酯合成活力的檢測方法不僅可以提高效率，而且也更具有針對(duì)性。目前的一些酯合成活力檢測方法通常利用特定的底物快速檢測，或者利用特定的酸和醇在一定條件下合成酯，通過高效氣相或液相檢測底物酸的減少量 （或酯的生成量）來定義合成酶活。但是目前常用的檢測方法（滴定法、高效液相色譜、高效氣相色譜）都存在著一定的缺陷性。而且由于脂肪酶催化合成的底物多樣性和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)?，?dǎo)致酯合成活力的檢測方法也是多樣的，沒有一種方法可以適用于所有的合成活力的檢測，往往需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的底物。但是隨著科技的進(jìn)步、實(shí)驗(yàn)儀器的更新以及新方法的建立，將會(huì)有一些效率更高、更經(jīng)濟(jì)簡便的方法替代現(xiàn)有的檢測手段應(yīng)用到具有酯合成活力的脂肪酶篩選中來。

在現(xiàn)有的工業(yè)化應(yīng)用中，作為21世紀(jì)具有競爭力的生物行業(yè)，其綠色環(huán)保的特點(diǎn)得到更多的國家政策的支持和企業(yè)的青睞。而生物酶作為一種綠色催化劑，不僅對(duì)環(huán)境污染，而且催化效率高，在一些生產(chǎn)中已經(jīng)逐漸取代了傳統(tǒng)的化學(xué)法。脂肪酶目前已經(jīng)被用于一些手性藥物中間體的拆分和合成相關(guān)具有應(yīng)用價(jià)值的酯，并通過相關(guān)反應(yīng)條件（有機(jī)溶劑種類、反應(yīng)時(shí)間、加酶量、底物的摩爾比）的優(yōu)化，達(dá)到我們預(yù)期的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。但是目前還存在著一定的缺陷性，許多的研究都只是出于實(shí)驗(yàn)室研究階段，離工業(yè)化應(yīng)用還有很長一段的距離。未來的研究方向是通過反應(yīng)器的設(shè)計(jì)優(yōu)化和技術(shù)手段的改進(jìn)，提高酶的純度、固定化手段以及反應(yīng)規(guī)模的擴(kuò)大。

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