酶聯(lián)適體分析法檢測動物源性食品中的卡那霉素殘留

趙秋伶，史素青，張尤華，于曉艷

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島125105；2.西北大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，陜西西安710069）

酶聯(lián)適體分析法檢測動物源性食品中的卡那霉素殘留

趙秋伶1，史素青2，張尤華1，于曉艷1

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島125105；2.西北大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，陜西西安710069）

建立了基于核酸外切酶Ⅰ的酶聯(lián)適體分析法，用于測定動物源性食品中的卡那霉素殘留。核酸適體和卡那霉素結(jié)合后，不再被核酸外切酶Ⅰ剪切，而能進一步聯(lián)結(jié)辣根過氧化物酶（HRP），催化四甲基二苯胺底物顯色，以450nm的吸光度與濃度的線性關(guān)系確定卡那霉素的檢出限?？疾炝税粷舛?、競爭反應(yīng)時間、核酸外切酶I用量及封閉液等因素對檢測的影響。在優(yōu)化的實驗條件下，建立的方法對卡那霉素檢測有高靈敏度，檢測限為3.26μg/L，線性范圍5～100μg/L；在4種肉類中添加5.0、20.0、50.0μg/kg的卡那霉素時，加標(biāo)回收率可達75.8%～90.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.2%～7.8%。該方法無需大型儀器，操作簡單，可用于動物源性食品中卡那霉素殘留的快速檢測。

卡那霉素，核酸適體，酶聯(lián)適體分析，動物源性食品

卡那霉素是第一代廣譜氨基糖苷類抗生素［1］，由于用藥方便、價格便宜，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛，常常被添加到飼料中促進動物的生長發(fā)育［2］。但是，殘留在畜產(chǎn)品中的卡那霉素被人類長期食用后，會對人體產(chǎn)生不同程度的損害［3］。歐盟、美國和中國等許多國家對該類抗生素在食品中的殘留限量都作了明確規(guī)定［4-5］。

酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）能滿足大批量樣品和現(xiàn)場快速檢測等要求，在食品安全分析等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用［6-7］。但抗體易受外界條件的影響，檢測結(jié)果假陽性率高，制約了ELISA的實際應(yīng)用。核酸適體是高親和性和特異性結(jié)合目標(biāo)分子的核苷酸序列片段［8-9］。由于具有選擇性高、易合成、易修飾和相對穩(wěn)定的優(yōu)點［10-11］，用核酸適體代替抗體發(fā)展ELISA，可以降低ELISA的成本，同時降低假陽性率，在食品安全分析領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景［12］。實際上，核酸適體在獸藥殘留分析中的應(yīng)用尚處于起步階段。除一些抗生素外，其他獸藥類的核酸適體還尚未被篩選［13-14］。

核酸適體作為識別元素的酶聯(lián)分析法（Enzyme Linked aptamer Assay，ELAA）在抗生素殘留分析中的應(yīng)用已有一定的基礎(chǔ)，競爭型ELAA已被成功建立并用于檢測赭曲霉素A［15］，檢測原理和抗體做識別元素的檢測完全相同，且都是顯色淺者為陽性。而具有新型檢測機理的ELAA研究甚少。本文利用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的固相核酸適體作為識別元素，以期建立外切核酸酶I依賴的酶聯(lián)適體分析法檢測動物源性食品中的卡那霉素殘留，豐富核酸適體免疫分析法的實際應(yīng)用，為保障我國動物源性食品質(zhì)量安全提供一種有效的技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸奈替米星、硫酸阿米卡星和恩諾沙星美國Sigma公司，使用前用水配成100mg/L儲備液；核酸外切酶I（Exonuclease I），10×Exonuclease I buffer大連寶生物工程有限公司；鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板、四甲基二苯胺（Tetramethylbenzidine）底物顯色液美國Thermo Scientific公司；Anti-Fluorescein（FITC）-HRP美國Millipore公司；檢測卡那霉素的ELISA試劑盒北京中檢維康技術(shù)公司；寡核苷酸大連寶生物工程有限公司；試樣（豬肉、豬肝、雞肉、魚肉） 購于市場；實驗用水18.2MΩ·cm超純水；其他試劑均為分析純。

Milli-Q超純水系統(tǒng)美國Millipore公司；電子分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司；高速冷凍離心機、微量可調(diào)移液器德國Eppendorf公司；SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀美國Molecular Devices公司；搖床、MSl Minishaker旋渦混合器和Ultra-Turrax T25均質(zhì)器德國IKA公司。

1.2實驗方法

1.2.1溶液的配制及緩沖液帶生物素（biotin）和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)簽的寡核苷酸序列A：5′-biotin-CACGCACGTCCATGATGGGGG TTGAGGCTA（FITC）AGCCGA-3′下劃線部分是卡那霉素的核酸適體，經(jīng)由高效液相色譜純化，首先用水配成100μmol/L儲備液。

PBS緩沖液：0.1mol/L，pH=7.4。

PBST緩沖液：0.1mol/L，pH=7.4，含2mmol/L MgCl2和0.12%Tween20。

結(jié)合緩沖液：20mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0，含50mmol/L NaCl，5mmol/L KCl和5mmol/L MgCl2。

PBSE緩沖液：0.01mol/L的PBS，pH=4.0，含0.4mmol/L的EDTA和2%三氯乙酸。

1.2.2檢測DNA的固定實驗在包被緩沖液PBS中進行，首先向PBS中加入檢測DNA（A），使得A的濃度為125nmol/L。鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板的凹槽用200μL洗滌緩沖液PBST洗滌三次，每次5min。然后在酶標(biāo)板的每個凹槽中加入100μL 125nmol/L的A，置于37℃搖床，反應(yīng)2h。A的5′端是生物素標(biāo)簽，通過生物素和鏈霉親和素的特異相互作用A包被到鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板的凹槽。凹槽用200μL PBST緩沖液洗滌三次，每次5min，以去除未反應(yīng)或吸附的A。然后加1%BSA做封閉反應(yīng)，反應(yīng)時間1h，反應(yīng)完畢用PBST洗滌3次。檢測DNA（A）包被的酶標(biāo)板立即用于下步反應(yīng)。

1.2.3酶聯(lián)核酸適體法的檢測卡那霉素儲備液用結(jié)合緩沖液稀釋成系列濃度，分別加入到包被了A的酶標(biāo)板的凹槽中，每口100μL，室溫孵育50min，核酸適體和卡那霉素充分反應(yīng)。接著在反應(yīng)液中加入1.2μL核酸外切酶I（Exo I，5U/μL）和11μL 10×Exo I緩沖液，在37℃孵育30min，未和卡那霉素作用的核酸適體被Exo I剪切，反應(yīng)完畢棄去反應(yīng)液，用200μL PBST洗滌緩沖液洗滌三次，每次5min，在洗滌的過程中被Exo I剪切掉的帶FITC標(biāo)簽的單核苷酸全部被去除。然后每口加100μL按1∶5000稀釋的Anti-FITCHRP，37℃反應(yīng)30min，移去反應(yīng)液，洗滌三次，最后每口加100μL四甲基二苯胺（TMB）底物顯色液，反應(yīng)20min，加25μL 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，反應(yīng)液由藍變黃，用酶標(biāo)儀測450nm的吸光度，同時用相機拍照。

1.2.4實驗條件的優(yōu)化

1.2.4.1DNA（A）的包被濃度的優(yōu)化考察了使用25、50、75、100、125、150、200nmol/L的A包被酶標(biāo)板后（無封閉步驟），外切核酸酶I（exo I）過量時，檢測1000μg/L的卡那霉素的A450值。

1.2.4.2封閉液的優(yōu)化核酸適體在最優(yōu)包被量125nmol/L的條件下，exo I過量時，用BSA、明膠、乳粉、酪蛋白等封閉液封閉后，考察檢測0μg/L卡那霉素的A450（空白）。

1.2.4.3exo I的用量的優(yōu)化當(dāng)DNA包被濃度為125nmol/L，封閉液為1%BSA時，考察exo I用量為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8μL（5U/μL）時，檢測0μg/L卡那霉素的A450（空白）。

1.2.4.4反應(yīng)時間的優(yōu)化當(dāng)DNA（A）和exo I用量一定時，考察20、30、40、50、60、70min下DNA（A）和100μg/L卡那霉素反應(yīng)時對A450的影響。

1.2.5特異性實驗為了考察該方法的特異性，選擇與其結(jié)構(gòu)類似的其他氨基糖苷類抗生素（新霉素、鏈霉素、慶大霉素、奈替米星和阿米卡星）及非氨基糖苷類藥物恩諾沙星作為對照參照物。在相同的測試條件下，當(dāng)卡那霉素的濃度為50μg/L，而其他糖苷類抗生素為100μg/L時，比較450nm處的凈吸收值，并計算交叉反應(yīng)率；當(dāng)卡那霉素及對照物的濃度為100μg/L，測定450nm處的凈吸收值，交叉反應(yīng)率為P/N。凈吸收值的計算見式（1），交叉反應(yīng)率見式（2）。

1.2.6樣品的提取與凈化稱取5g（精確至0.01g）試樣50mL離心管中，加入10.0mL磷酸鹽緩沖液（PBSE）均質(zhì)2min，于平板振蕩器上振蕩提取10min，離心10min（4500r/min），將上清液轉(zhuǎn)移到另一個50mL離心管中。在殘渣中再加入10.0mL PBSE，重復(fù)上述操作，合并上清液，用1.0mol/L的NaOH調(diào)pH為8.0±0.2，0.22μm濾膜過濾，待測定。

1.2.7樣品的添加回收實驗選擇豬肉、豬肝、雞肉和魚肉四種肉類試樣進行樣品添加回收實驗。向樣品中分別添加5.0、20.0、50.0μg/kg三個水平的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)液，室溫下放置過夜后用1.2.6方法處理，用建立的方法檢測。

1.2.8檢出限（LOD）的確定根據(jù)LOD的定義，檢出限為空白加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的卡那霉素質(zhì)量濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測原理

檢測原理如圖1所示，檢測DNA（A）的5′端標(biāo)記了生物素基團（biotin），通過生物素和鏈霉親和素的特異相互作用，A被固定到鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板，A中下劃線序列為卡那霉素的核酸適體，另一部分為輔助序列。當(dāng)加入卡那霉素時，核酸適體和卡那霉素特異性結(jié)合導(dǎo)致核酸適體構(gòu)象發(fā)生變化，將不再被核酸外切酶I剪切，3′端第七個堿基上標(biāo)記的異硫氰酸熒光素基團（FITC）被保留下來，它能進一步捕獲Anti-FITC-HRP（帶HRP標(biāo)簽的FITC抗體），最終，HRP能催化無色的TMB底物溶液顯藍色，如果加入2mol/L的H2SO4，產(chǎn)物由藍色變成黃色。相反，沒有卡那霉素，當(dāng)加了核酸外切酶I時，核酸外切酶I從3′端開始將核酸適體的堿基序列一個一個的水解，F(xiàn)ITC跟著掉下來。聯(lián)結(jié)HRP的linker被切掉，在洗滌步驟中被洗走，后面的步驟無法進行，TMB底物無顏色顯現(xiàn)。A中綠色部分為輔助序列，因為這段序列的存在，反應(yīng)離固相表面有一定距離，消除了空間障礙，反應(yīng)效率更高。

圖1　檢測卡那霉素的酶聯(lián)適體分析傳感示意圖Fig.1　Sensing principle of enzyme-linked aptamer assay for kanamycin

2.2實驗條件的優(yōu)化

2.2.1DNA（A）的包被濃度的優(yōu)化首先對DNA（A）的包被濃度進行優(yōu)化，實驗結(jié)果見圖2：開始時隨A濃度的增加，A450（450nm處的吸光度）增大，這是因為隨著A濃度的增加，固定到酶標(biāo)板上的A數(shù)量增多，參與反應(yīng)的A的數(shù)量也增加。當(dāng)A濃度為125nmol/L時，A450值最大，表明參與反應(yīng)的A數(shù)量達最大值，此時微孔板已被A飽和。所以，本實驗中DNA包被濃度采用125nmol/L。

圖2　不同濃度DNA（A）包被酶標(biāo)板對檢測結(jié)果的影響Fig.2　Influences of DNA（A）concentration coating onto microplate wells on detection results

2.2.2封閉液的優(yōu)化非特異性吸附引起的背景顏色較深，同時由于檢測限的定義與空白值的大小緊密相關(guān)［16］，因此試圖通過封閉液的優(yōu)化來降低空白值。根據(jù)實驗結(jié)果（圖3）：封閉液的種類和濃度均會影響空白值，綜合考慮，1%BSA做封閉液時，空白檢測值最小（A450＝0.125），因此選擇1%BSA作為封閉液。

圖3　封閉液對空白測定值的影響（n=3）Fig.3　Influences of blocking solutions on determination of blank value（n=3）

2.2.3exo I的用量的優(yōu)化實驗結(jié)果表明（圖4）：exo I用量為1.2μL時，A450（空白）值已達最小，以后也不再降低，表明此時微孔板上包被的DNA（A）已被exo I完全剪切。所以，本實驗中exo I的用量采用1.2μL。

圖4　卡那霉素的用量對空白測定值的影響（n=3）Fig.4　Influences of exocluease I’s dosage on determination of blank value（n=3）

2.2.4反應(yīng)時間的優(yōu)化結(jié)果見圖5。隨著反應(yīng)時間的增加，A450隨之增大，且在50min時達到最大，說明此時反應(yīng)程度已達最大；此后A450不再增加，甚至稍有降低，說明此時有副反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致反應(yīng)程度降低。因此，確定最佳反應(yīng)時間為50min。

表1　交叉反應(yīng)的實驗結(jié)果（n=3）Table 1　The experimental results of cross reaction（n=3）

圖5　反應(yīng)時間對檢測結(jié)果的影響（n=3）Fig.5　Influences of reaction time on determination results（n=3）

2.3實驗結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化的實驗條件下，考察了此顯色體系對梯度稀釋的卡那霉素的響應(yīng)。隨著卡那霉素濃度的增加，溶液顏色逐漸加深，450nm的吸光度值逐漸增大（圖6）。在5～100μg/L范圍內(nèi)，A450與卡那霉素質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系（見圖7），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 0.0136x+0.162，相關(guān)系數(shù)R2=0.992。該方法的LOD值為3.26μg/L。該酶聯(lián)適體分析法的靈敏度遠低于歐盟規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)120μg/L［17］，即滿足定量檢測要求。

圖6　TMB底物顯色體系對不同濃度卡那霉素的吸光度響應(yīng)Fig.6　Response of absorbance change at 450nm of TMB substrate system upon analyzing different concentrations of kanamycin

圖7 校正曲線（n=5）Fig.7　Calibration curve（n=5）

2.4方法特異性分析

特異性分析的實驗結(jié)果見圖8，可見，除卡那霉素外，即使其他抗生素的濃度提高了2倍，其吸光度值也無明顯的提高。從誤差線可知，核酸適體對對照試劑有微弱信號，但非常小，在系統(tǒng)誤差范圍內(nèi)，可以忽略。交叉反應(yīng)率見表1，由表1數(shù)據(jù)可知交叉反應(yīng)率均小于4%，表明該方法對卡那霉素的檢測具有較高的特異性。

圖8　不同物質(zhì)作用下TMB體系吸光度變化值（n=3）Fig.8　Absorbance value changes of TMB system under the action of different substances（n=3）

表2　回收率實驗（n=5）Table 2　The experiment results of recovery（n=5）

2.5實際樣品的添加回收實驗

選擇豬肉、豬肝、雞肉和魚肉四種肉類試樣進行添加回收實驗，以驗證本方法應(yīng)用于實際樣品檢測的準(zhǔn)確度，同時采用ELISA試劑盒進行對照。計算各水平的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表2所示。核酸外切酶I依賴的酶聯(lián)適體法檢測卡那霉素在四種肉類產(chǎn)品的加標(biāo)回收率為75.8%～90.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～7.8%，且檢測結(jié)果與ELISA方法一致。表明本方法準(zhǔn)確度和靈敏度良好，能夠滿足動物原性食品中卡那霉素殘留檢測的要求。

3　結(jié)論

以單鏈DNA作為識別核酸適體，建立了檢測卡那霉素的核酸外切酶Ⅰ依賴的酶聯(lián)核酸適體分析方法。在優(yōu)化的實驗條件下，在5～100μg/L范圍內(nèi)，450nm處的吸光度與濃度成良好線性關(guān)系，檢測限為3.26μg/L。在實際樣品肉類中添加適量的卡那霉素后，添加回收率75.8%～90.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～7.8%。該方法能用于動物源性食品中卡那霉素殘留的檢測，且方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足大批量樣品和現(xiàn)場快速檢測等要求。

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Enzyme-linked aptamer assay for detection of kanamycin residues in animal derived food

ZHAO Qiu-ling1，SHI Su-qing2，ZHANG You-hua1，YU Xiao-yan1
（1.College of Mining Industry Technology，Liaoning Technical University，Huludao 125105，China；2.College of Chemistry&Materials Science，Northwest University，Xi’an 710069，China）

Exonuclease I-based enzyme-linked aptamer assay for the detection of kanamycin residues in animal derived food was established in this paper.Aptamer binding with kanamycin could no longer be digested by exonuclease I，but could further specifically capture the horseradish peroxidase（HRP）that catalyzed methyenedianiline substrate to produce color change.Determination of the limit of detection was based on linear relationship between absorbance value at 450nm and the concentration of kanamycin.The effects of coated concentration，competitive reaction time，dosage of exonuclease I and blocking solutions on the detection were investigated.The results showed that under the optimal conditions，the established exonuclease I-depended enzyme-linked aptamer analysis of kanamycin have high sensitivity，the detection limit was 3.26μg/L with linear ranging from 5 to 100μg/L.When kanamycin of 5.0，20.0 and 50.0μg/kg were added to four animal derived foods，the recovery rates ranged from 75.8%to 90.6%，the relative standard deviation for RSD ranged from 4.2%to 7.8%.The method had simple operation without need large instrument and could be used for fast detection of kanamycin residues in animal derived foods.

kanamycin；aptamer；enzyme-linked aptamer assay；animal derived food

TS201.3

A

1002-0306（2015）10-0086-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.009

2014-12-03

趙秋伶（1979-），女，博士，講師，研究方向：化學(xué)生物學(xué)與食品安全分析。

國家自然科學(xué)基金（21004047）；陜西省青年科技新星人才項目（2014KJXX-62）。