磁珠法核酸自動提取儀在分子生物學領域的應用

羅 英

（浙江迪安診斷技術股份有限公司，杭州 310000）

自沃森－克里克的DNA雙螺旋模型誕生以后，生物學進入到了一個全新的時代，在生物學界，無論是進行病原微生物的檢測、物種鑒定，還是進行物種起源、多樣性評估及其親緣關系、系統(tǒng)進化等的研究，首先都需要對核酸進行分離純化，因此對DNA的提取成為生物醫(yī)藥領域甚至農林牧漁等領域內所有學科進行科學研究的基礎。而能否提取出高質量的核酸則是核酸分子生物學試驗中的關鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關系到后續(xù)試驗的成?。?］。因此核酸提取是分子生物學的基本方法，也是核酸分析中最關鍵的方法?？茖W家們因此開出發(fā)了一系列的核酸提取方法，包括經典的酚氯仿抽提法，新發(fā)展的硅膠膜吸附法、磁珠分離法等。而隨著基因診斷在臨床疾病的診斷和監(jiān)測中發(fā)揮著日益重要的作用，基因診斷對核酸檢測賴以完成的前提技術——核酸提取技術提出了新的要求，高效、便捷、環(huán)保、大通量、自動化成為核酸提取技術發(fā)展的主流方向。在這種背景下，核酸自動提取儀應運而生，很多公司紛紛推出自己的全核酸自動提取儀器，各種原理的都有，本文將對核酸自動提取儀原理及分類作一概述，重點介紹磁珠法核酸自動提取儀的原理、分類、優(yōu)勢及應用現狀。

1 核酸自動提取儀原理及分類

核酸自動提取儀，又叫核酸自動純化儀，是一種應用配套的核酸提取試劑來自動完成樣本核酸快速提取工作的儀器。根據其提取原理可分為離心柱法和磁珠法兩種。離心柱法全核酸自動提取儀主要采用離心機和自動移液裝置相結合的方法，通量一般在1～12個樣本，操作時間和手工提取差不多，并不能提高實際工作效率，且價格昂貴，不同型號儀器的耗材也不能通用，僅適合經費充足的大型實驗室使用。而磁珠法核酸自動提取儀則是以磁珠為載體，利用磁珠在高鹽低pH值下吸附核酸，在低鹽高pH值下與核酸分離的原理，再通過移動磁珠或轉移液體來實現核酸的整個提取純化過程。由于其原理的獨特性，所以可設計成很多種通量，既可以單管提取，也可以提取8～96個樣本，且其操作簡單快捷，提取96個樣本僅需30～45min，大大提高了實驗效率，且成本低廉，因而可以在不同實驗室使用。

根據儀器型號大小又可分為兩大類：一類是大型的自動化儀器，一般稱為自動液體工作站；另一類是小型的自動化儀器，利用封裝好的配套試劑自動完成核酸提取純化的過程。大型自動液體工作站，功能非常強大，可以自動完成液體分液、吸液等工作，甚至可以將擴增、檢測等儀器設備整合在一起，一次性實現標本提取、擴增、檢測全自動化操作。提取核酸只是其功能的一個應用，因為其設備成本高昂，運行成本高，不太適合常規(guī)實驗室使用，一般都應用在一次提取大量（至少96個，一般幾百個）同一類標本的實驗需求上，所以真正得到應用的比較少。而小型的自動化儀器是通過運行結構的特殊設計來達到自動提取核酸的目的，其儀器設備和運行成本低，操作方便，因而得到越來越多的應用，近年來已有很多種不同機型陸續(xù)投放市場。

2 磁珠法核酸自動提取儀的原理、分類及優(yōu)勢

2.1 磁珠法核酸自動提取儀的原理與分類

磁珠法核酸自動提取儀一般可分為磁棒法和抽吸法兩種。抽吸法，也叫移液法，就是通過液體的轉移來實現核酸的提取純化，一般通過操作系統(tǒng)控制機械臂來完成移液。其過程與原理包括：1）裂解：在樣品中加入裂解液，通過反復吹打混勻及加熱，破碎細胞釋放核酸；2）吸附：在樣品裂解液中加入磁珠，充分吹打混勻，利用磁珠在高鹽低pH值下對核酸具有很強親和力的特點，吸附核酸，在外加磁場作用下，磁珠與溶液分離，利用吸頭將液體移出棄至廢液槽，吸頭棄掉；3）洗滌：撤去外加磁場，換用新吸頭加入洗滌緩沖液，反復吹打混勻，去除雜質，在外加磁場作用下，將液體移出；4）洗脫：撤去外加磁場，換用新吸頭加入洗脫緩沖液，反復吹打混勻，結合的核酸即與磁珠分離，從而得到純化的核酸。

磁棒法，即通過磁珠的轉移來實現核酸的分離純化，一般通過儀器里磁棒的運動，來實現磁珠從樣本裂解液／結合液到洗滌液，再到洗脫液的轉移，從而自動完成核酸分離與純化的全過程。其過程與原理包括以下幾個步驟：1）裂解吸附：在含磁珠的裂解液中加入待處理樣品，充分混合，裂解細胞（適當加熱有助于細胞的裂解），釋放的核酸在高鹽低pH值下特異性的吸附到磁珠上，而蛋白質等分子則不被吸附而留在溶液中；2）洗滌：在磁棒的磁場作用下，磁珠與溶液分離，磁棒將磁珠轉移至洗滌緩沖液中，經過反復洗滌，去除蛋白質無機鹽等雜質；3）洗脫：洗滌結束后，磁棒又將磁珠轉移至洗脫緩沖液中，在低鹽高pH值下核酸從磁珠上被洗脫下來，最后磁棒又將磁珠移出，即完成核酸的全部提取。

2.2 磁珠法核酸自動提取儀的優(yōu)勢

傳統(tǒng)的核酸提取技術包含沉淀、離心等操作，并需要大量的生物樣本，這些純化方法的步驟繁雜、費時長、收率低，且需接觸有毒試劑，因而很難實現自動化操作；而采用磁珠為載體的分離技術，無需離心，無需大量檢材，也無需接觸酚／氯仿等有毒試劑，且操作簡單方便，很容易實現自動化操作，30min就能實現樣品的快速、高效制備，是未來核酸純化方法發(fā)展的一個重要方向。因而磁珠法核酸自動提取儀，具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法比擬的優(yōu)勢，主要體現在［2－3］：①能夠實現自動化、高通量操作。核酸抽提技術與磁珠自動化完美結合，實現無交叉污染的高通量自動化核酸抽提，目前已有96孔的核酸自動提取儀，能夠一次性實現對96個樣品的快速處理，符合生物學高通量的操作要求，使得傳染性疾病爆發(fā)時能夠進行快速及時的應對，這一特點使得傳統(tǒng)方法望塵莫及；②操作簡單、快速。整個提取流程只有裂解－結合－洗滌－洗脫四個步驟，無需專業(yè)培訓技術人員，即可從樣本中快速高效的提取靶核酸，且大多可以在30～45min內完成；③安全環(huán)保。整個提取過程無需用到傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒的有機試劑，安全無毒，綠色環(huán)保，且采用封閉式空間，將對實驗操作人員的傷害降低到最少，完全符合現代環(huán)保理念；④高純度，高得率。磁珠與核酸的特異性結合使得提取的核酸純度高、濃度大，且提取的核酸可直接用于PCR等后續(xù)試驗；⑤無污染，且結果穩(wěn)定。采用智能化操作系統(tǒng)，嚴格控制孔孔之間污染，并采用一次性塑料提取套管，避免不同批次間污染；同時保證實驗結果的穩(wěn)定性和可重復性，避免人工操作引起的差異及錯誤；⑥成本低廉，便于廣泛應用。由于磁珠合成采用的都是低價無機和有機原料，無須特殊的儀器設備，使得最終的合成和研發(fā)成本都很低，符合我國的基本國情和經濟現狀；⑦可以同時處理不同類型的樣本，適應了建立DNA數據庫所需的不同類型大量生物樣本的提取，為我國DNA數據庫的建設鋪平了道路，打下了基礎。

3 磁珠法核酸自動提取儀的選擇

隨著磁珠在基因檢測領域的應用，越來越多的核酸自動提取裝置被開發(fā)出來。因此如何選擇一款合適的核酸自動提取儀，就需要我們根據機器特點并結合實際需求進行認真選擇。

磁珠法核酸自動提取儀根據移液特點主要分為磁棒法和抽吸法兩大類，而這兩種類型的儀器又各有利弊。抽吸法磁珠核酸自動提取儀通過吸頭轉移液體實現核酸的分離純化，其優(yōu)點是：（1）無需提前分裝液體；（2）移液過程不會產生因液體掉落造成交叉污染；（3）可以適用于不同的磁珠法核酸提取試劑，即凡是手動法可以操作的試劑基本上都可以在該類儀器上使用。但這類儀器，也有一個很大的缺點：為了盡可能徹底地去除廢液，吸頭會伸到深孔板孔底，但為了避免去除廢液的時候吸走磁珠，吸頭又不能靠磁珠太近，因而每次抽廢液的時候總會有一小部分液體殘留，特別是磁鐵設計在底部的裝置，因為磁珠被磁鐵吸附在深孔板底部，所以吸頭不能靠底部太近，這樣每次的洗滌液就不能去除完全，而殘留的洗滌液中的鹽和乙醇／異丙醇會直接影響后面的洗脫效率和PCR成功率；磁鐵設計在側面的裝置殘留的液體相對較少，但其洗脫的效率卻不好，因其僅靠DNA自行溶解到洗脫緩沖液中，所以會需要較長時間，該類96核酸自動提取儀，提取一輪的時間差不多是32通量磁棒法的5倍。另外該類儀器目前主要由國外的一些廠家研制，主要依靠機械臂進行運行，需要專業(yè)編程和專業(yè)維護，且移液需要很多槍頭，因此機器設備成本比較昂貴，所需耗材成本也不低，因而僅推薦經費充足的實驗室選用。

磁棒法核酸自動提取儀相對應用較多，通量通常有8、16、32、96通道，相對于抽吸法，磁棒法的最大優(yōu)點就是：每一步的液體不會殘留，因為磁棒只帶走磁珠，然后轉移到下一個步驟相應的反應孔中，且其編程簡單，易維護；不足之處就是需要提前手工加試劑，且不能將手動法磁珠提取試劑直接拿來使用，而需要根據機器特點優(yōu)化試劑操作。在選擇磁棒法提取儀時，我們還需要根據實際試驗需要盡可能選擇功能更齊全的，比如可以加熱、制冷的，且每個加熱槽最好獨立溫控，這樣就可以設置加熱、裂解、洗脫的不同溫度，有助于提高裂解和洗脫效率，而采用制冷裝置的則有助于RNA提取過程中避免RNA的降解。最重要的是，帶動磁棒的電機要能帶動磁棒進行液體的快速混勻和攪拌，這樣才能有利于自動化和有助于裂解和漂洗的徹底。磁棒法的通量最好選擇32通道，96通道雖然通量更高，但96個磁棒上面的液體在從一個板轉移至另外一個板的過程中可能會滴落造成污染，而32通道的磁棒運行軌跡不經過其他樣本的上空，不會造成交叉污染。目前國內基本都是該類型的提取儀，機器成本低，且效果也與國外產品相當，比較而言，國產磁珠法核酸自動提取儀成本低廉，供貨周期短，且不依賴于進口試劑。

磁珠法核酸自動提取儀國內外有很多種品牌，目前國際市場上的主流品牌有：Thermo的Kingfisher系列、InnuPure?C12／C16、ROCHE 的 MagNA Pure LC、Qiagen的 Biorobot 9604、ABIPrism?6100Nucleic Acid PrepStation、epMotion 5075TMX、QuickGene610等；國內品牌主要有：西安天隆的NP968系列、廈門歐達的 MP－120系列、臺灣圓點奈米的Smart LabAssist－32、科華生物的 DP－3000、上海浩源（臺灣基亞）的 ChiTaSBSS1200、杭州博日的NPA－32等。

4 磁珠法核酸自動提取儀的應用

磁珠法核酸自動提取儀基于其獨特的磁珠分離技術，實現了核酸提取的高通量自動化，是傳統(tǒng)手工提取方法的大革命。由于其操作簡單、快速，重復性好，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中分離出DNA和RNA來，可應用在疾病控制中心、臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學鑒定、環(huán)境微生物檢測、食品安全檢測、畜牧業(yè)和分子生物學研究等多種領域。

4.1 在疾病控制中心的應用

磁珠法核酸自動提取儀可用于解決H7N9禽流感、SARS（Severe Acute Respiratory Syndromes）、兒童手足口病、麻疹病毒等的快速自動化疾病監(jiān)測系統(tǒng)，提高重大疫情應對響應能力。

2013年春節(jié)后，我國突發(fā)了H7N9禽流感。面對重大疫情，由國家863計劃支持取得的具有自主知識產權的核酸提取儀及配套提取試劑，成功應用于H7N9禽流感篩查工作，實現了從呼吸道分泌物樣品中提取H7N9禽流感病毒核酸到檢測的自動化過程，為H7N9禽流感篩查提供了快速集成解決方案，有力地支撐了我國應對禽流感的防控工作。

目前，核酸提取儀及配套提取試劑已經在浙江省H7N9定點篩查醫(yī)院浙江大學第一附屬醫(yī)院，北京市、陜西省、青海省、西安市和湖州市等各級疾病預防控制中心進行了超過2400多例流感樣的H7N9病毒核酸提取及篩查。國產的核酸提取儀及試劑產品與國外同類產品相比具有快捷方便、價格便宜、供貨期短等優(yōu)點，適合在大面積篩查中應用。

以上數據來源于國家科技成果網2013年5月1日科技新聞：國產核酸提取檢測設備助力H7N9禽流感篩查。

4.2 在輸血安全方面的應用

輸血是臨床上治療和搶救病人常用的醫(yī)療措施，近年來，隨著醫(yī)療技術的不斷進步，安全輸血越來越受到人們的重視。而輸血相關傳染病的預防和控制已成為全社會關注的焦點，隨著檢測技術的不斷進步，輸血傳播相關病毒的危險性大大降低，但由于我國是肝炎的高發(fā)區(qū)，艾滋病亦處于快速發(fā)展趨勢［4］，為避免病毒感染傳播，加強輸血安全檢查尤為必要，國內外眾多采供血機構因此在血液篩選中引入核酸檢測（Nucleic acid test，NAT）。應用血液核酸檢測技術，對HBV、HCV和HIV等病毒感染者進行檢測，可以有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測定的“窗口期”，并檢出病毒變異株，從而降低輸血風險，提高輸血安全。而核酸提取是NAT檢測的重要環(huán)節(jié)，核酸提取效果直接影響到NAT檢測的靈敏度和特異性［5］。因此核酸提取采用的試劑和方法就顯得尤為重要。由于在大批量進行血液篩查時手工混樣繁瑣、難標識，且核酸手工提取技術要求高、操作復雜、耗時，結果重現性差及進口試劑成本高等諸多因素［6］，限制了該技術在我國血液常規(guī)篩查中的推廣應用。為了進一步提高血液的安全性，很多科研者紛紛嘗試將國產自動化儀器及NAT試劑應用到血液核酸篩查中［4］，而磁珠法核酸自動提取儀不僅可以高效的提取血液中的核酸，而且可以進行高通量處理，從而大大縮短操作時間，提高工作效率，因而在血液篩查方面取得了廣泛應用。

早在2003年前日本和羅氏公司應用MPLC全自動核酸提取系統(tǒng)應用于血液篩查的研究［7］。2004年葉賢林等［8］人也將磁珠法核酸自動提取儀用于血液篩查中HBV DNA的提取，結果發(fā)現該方法靈敏度高，能在1h內迅速完成480例份核酸的提取，大大提高了工作效率。2005年葉賢林等［9］人將磁珠法核酸自動提取儀應用于16 512份血液標本中HBV DNA的提取，并進行基因分型分析，結果取得了良好的應用效果。

4.3 在臨床分子診斷領域的應用

磁珠提取純化系統(tǒng)可快速高通量的處理臨床樣品，提取的核酸可直接用于后續(xù)的分子診斷。采用磁珠法自動核酸純化儀可以高效便捷地應用于乙肝、丙肝、艾滋病、流行性病毒、感染性病毒等各種病毒、病原體核酸的快速提取。

2003年Julia H等［10］人比較了兩種核酸自動提取儀與手工提取試劑盒在提取腸病毒RNA上的效果，結果表明四種方法都可以有效的應用于腸病毒RNA的提取。2004年Deborah Wilson等［11］人比較了磁珠法核酸自動提取儀與其他四種商業(yè)化核酸提取試劑從臨床樣本中提取嗜肺軍團菌的效率，結果發(fā)現用磁珠法核酸自動提取儀從痰液中提取軍團菌的濃度遠高于其中三種商業(yè)化核酸提取試劑盒提取的核酸。2005年Kurt Beuselinck等［12］人運使用自動樣本準備系統(tǒng)通過磁珠從血清或血漿中提取HCV、HBV、CMV和EBV的核酸，提取的核酸直接進行定量PCR，結果與手工操作相比，大大縮短了操作時間，而且結果穩(wěn)定可靠。2007年K.Loens等［13］人比較了磁珠法核酸自動提取儀與QIAGEN手工法從不同臨床樣本中提取核酸的效率，結果表明核酸自動提取儀無論是從咽拭子還是從全血中提取核酸，均比手工法產量高。2011年易勇等［14］人比較了國產磁珠法核酸自動提取系統(tǒng)與傳統(tǒng)的沉淀離心提取法提取血清HBV DNA的效果，結果表明國產磁珠法核酸自動提取系統(tǒng)對血清HBV DNA的提取效果良好，操作簡單，自動化程度高，重復性好，適宜用于臨床HBV DNA檢測前處理的核酸提取。

5 在法醫(yī)學領域的應用

對于法醫(yī)工作而言，核酸提取的效率和穩(wěn)定性都是十分重要的。磁珠提取純化系統(tǒng)與專門的法醫(yī)樣品核酸提取磁珠試劑配合使用，可從不同來源的材料中純化高質量的DNA，包括煙蒂、毛根、干血、指甲、血痕等，最大處理量可達96個樣品／每次。

2009年楊電等［4］人應用國產磁珠結合自動化核酸提取儀批量提取血痕、口腔拭子、軟骨、口香糖等9 100份生物檢測的DNA，結果表明磁珠法自動化核酸提取儀具有實驗條件標準統(tǒng)一、操作穩(wěn)定可靠、重復性好、效率高、速度快、減輕檢驗人員的勞動強度等優(yōu)點，可用于案件中常見的大部分生物樣本核酸的抽提。

2009年匡金枝等［15］人比較了應用磁珠法核酸自動提取儀與Chelex－100－工作站法、手工法提取1 552份各類涉案檢測DNA的效果，結果表明磁珠法核酸自動提取儀提取DNA效果最佳，且較手工操作DNA檢測時間可縮減1.25倍。

隨著生物和醫(yī)學技術的快速發(fā)展，原有的手工純化核酸的方法，已經很難滿足大規(guī)模、高通量的實驗要求，因此出現了許多核酸分離純化的新技術及商品化試劑，其中采用磁珠分離是一種已被證實為高效、簡便、易于自動化的可行方法［16］。隨著磁珠分離技術在生物科學領域不斷普及和廣泛的應用［17］，一些生物制品公司將磁珠分離技術用于核酸自動提取，大大提高了核酸提取的效率，降低了人工操作的誤差［18］。目前，國外已有數家公司的核酸自動提取系統(tǒng)進入市場；國內一些公司也開始各展所長分別研發(fā)核酸提取用磁珠及自動化設備，并有相應的產品上市。目前已有很多研究表明，國產磁珠法自動核酸提取系統(tǒng)的應用效果不遜于現在普遍采用的沉淀離心提取法，因此非常值得推廣使用。同國外進口價格昂貴的同類儀器和磁珠試劑相比，儀器試劑的國產化能顯著降低使用成本，有利于節(jié)省社會財富和衛(wèi)生資源［14］，因此國產磁珠法核酸自動提取系統(tǒng)具有較好的應用潛力。相信隨著核酸檢測技術在分子生物學等各個領域的廣泛應用，磁珠法核酸自動提取儀在核酸提取中將發(fā)揮越來越重要的作用，而各種不同類型的核酸自動提取儀，將為各分子生物學實驗室的核酸提取完全實現自動化提供條件。

［1］ 張麗，楊蓮茹，吳紹強.核酸提取方法的研究進展［J］.中國動物檢疫，2011，28（12）：75－78.

［2］ 王平康，駱延，王光志，等.磁珠法快速提取鑒定 DNA的實驗研究［J］.生物學通報，2006，41（6）：50－51.

［3］ 楊電，劉宏，劉超，等.國產磁珠結合自動化工作站批量提取生物檢材DNA的應用［J］.中國法醫(yī)學雜志，2009，24（6）：404－406.

［4］ 葉賢林，孫斌斌，楊寶成，等.自動化核酸擴增技術（NAT）在血液篩查中的應用研究［J］.中國輸血雜志，2008，21（11）：837－839.

［5］ 陳曉東，陶志華，周武.核酸提取方法在聚合酶鏈反應測定乙肝病毒核酸中的評價［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2002，25（4）：212－214.

［6］ 夏嘉陵，萬朝敏.聚合酶鏈反應自動化的歷程及其進展［J］.國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2003，24（4）：208－210.

［7］ Meng Q，Wong C，Rangachari A，et al.Automated multiplex assay system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA，hepatitis RNA，and human immunodeficiency virus type 1RNA［J］.J Clin Microbiol，2001，39（12）：2937－2945.

［8］ 葉賢林，王良華，尚桂芳等.血液混樣HBV DNA全自動提取方法的應用研究［J］.中華醫(yī)學研究雜志，2004，4（10）：876－877.

［9］ 葉賢林，周一炎，楊立新，等.血液HBV DNA全自動檢測及基因分型分析［J］.中國輸血雜志，2005，18（2）：94－95.

［10］Julia H.Knepp，Melissa A，and Geahr，Michael S.Forman.Comparison of Automated and Manual Nucleic Acid Extraction Methods for Detection of Enterovirus RNA［J］.Journal of Clinical Microbiology，2003，41（8）：3532－3536.

［11］Deborah Wilson，Belinda Yen－Lieberman，Udo Reischl.et al.Comparison of Five Methods for Extraction of Legionella pneumopila from Respiratory Specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，2004，42（12）：5913－5916.

［12］Kurt Beuselinck，Marc van Ranst，and J.Van Eldere.Automated Extraction of Viral－Pathogen RNA and DNA for High－Throughput Quantitative Real－Time PCR［J］.Journal of clinical microbiology，2005：5541－5546.

［13］K.Loens，K.Bergs，D.Ursi，etl.Evaluation of NucliSens easyMAG for Automated Nucleic Acid Extraction from Various Clinical Specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，45（2）：421－425.

［14］易勇，趙煥生，賈莉萍，等.國產磁珠核酸自動提取系統(tǒng)對HBV－DNA檢測前處理的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21（8）：1906－1908.

［15］匡金枝，聶同鋼，楊智，等.法醫(yī)物證DNA自動化檢驗技術體系的研究［J］.中國法醫(yī)學雜志，2009，24（3）：164－167.

［16］張春艷，游振斌，蘭旺仁.ASTAR MP－120核酸自動提取儀的原理及應用［J］.生命科學儀器，2006，4（12）：52－53.

［17］徐曉可，吳清平，張菊梅，等.免疫磁珠分離技術在常見食源性致病菌檢測中的應用［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（5）：1196－1198.

［18］易勇，敬華.免疫磁珠分離技術在醫(yī)學檢驗中的應用［J］.總裝備部醫(yī)學學報，2010，12（4）：239－241.