泌尿生殖道支原體培養(yǎng)鑒定方法的分析

陶建萍

（廣西梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科 廣西 梧州 543300）

支原體是一種能獨(dú)立生活，介于細(xì)菌與病菌之間最簡單的原核生物。有80多種廣泛分布于自然界，目前已知人類支原體有十多種［1］。近年來支原體已廣泛成為非淋病泌尿生殖道感染的主要病原菌［2］，因其傳播快，范圍廣，已成為世界備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題［3］。從十九世紀(jì)六十年代開始至今，歐美國家就從支原體的生物學(xué)特性，培養(yǎng)，藥敏，等方面展開了廣泛的研究。進(jìn)十年來，我國對(duì)支原體的流行病學(xué)和耐藥性等方面也進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)報(bào)告，在這些報(bào)道中［4］－［9］發(fā)現(xiàn)支原體分離培養(yǎng)，鑒定方法均普遍 存在著一些問題［10］，其中比較多的是單憑肉湯培養(yǎng)顏色的變化來判斷有無支原體生長，而不是根據(jù)支原體在固體培養(yǎng)基上的典型菌落來判斷有無支原體，這就容易受到其他因素干擾，導(dǎo)致支原體培養(yǎng)鑒定假陽性和假陰性。本文綜合有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道就支原體生物學(xué)特性，培養(yǎng)特性，國內(nèi)外支原體培養(yǎng)的方法，肉湯培養(yǎng)液顏色及支原體假陽性的問題進(jìn)行探討。

1 常見生殖道支原體

人類生殖道支原體最常見的有解脲支原體（Uu），人型支原體（MH），生殖道支原體（MG）發(fā)酵支原體［11］。致病性較強(qiáng)的主要是Uu和MH。解脲支原體長居在人的泌尿生殖道黏膜，引起成人的泌尿生殖系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和結(jié)石，各種慢性急性婦科炎癥，男女不育癥，孕婦早產(chǎn)和男性慢性前列腺炎［12］。

2 生物學(xué)特性

解脲支原體（Uu）在固體培養(yǎng)基上菌落表面有粗顆粒，在適宜培養(yǎng)基中可轉(zhuǎn)呈光滑，并發(fā)育成典型的‘荷包蛋’狀菌落，不被青霉素抑制，對(duì)紅霉素高度敏感，支原體營養(yǎng)要求高于一般細(xì)菌，支原體在生長過程中可分解尿素。

3 支原體培養(yǎng)特性

支原體的特征是不具有細(xì)胞壁，能通過除菌濾器，能在人工培養(yǎng)基上生長，但營養(yǎng)條件高，培養(yǎng)需要供給膽固醇和新鮮酵母侵膏，同時(shí)還要添加少許雞蛋清或馬血清［13］。支原體培養(yǎng)基一般有三種：轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，肉湯增菌培養(yǎng)基和瓊脂固體培養(yǎng)基。

4 支原體培養(yǎng)及鑒定方法

追根溯源，從支原體培養(yǎng)的最初研究開始，支原體的鑒定就是依據(jù)瓊脂固體培養(yǎng)基上的典型菌落形態(tài)和生化反應(yīng)，在美國支原體培養(yǎng)鑒定按《臨床生物手冊(cè)》［14］依據(jù)固體培養(yǎng)基上的固形菌落形態(tài)的生化反應(yīng)鑒定支原體。國內(nèi)1997年《全國臨床檢驗(yàn)操作》第二版和曹三璞主編《支原體與支原體病》等國內(nèi)相關(guān)權(quán)威性專業(yè)書籍中介紹支原體培養(yǎng)方法同樣包括肉湯增菌和轉(zhuǎn)種固體平板兩部分鑒定支原體。因此，無論國內(nèi)外判斷支原體陽性結(jié)論最終建立在培養(yǎng)基的典型菌落。完整的支原體培養(yǎng)過程應(yīng)有兩步，第一步肉湯增菌觀察顏色變化，第二步將增菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)瓊脂固體培養(yǎng)基觀察其典型菌落形態(tài)，最終準(zhǔn)確可靠的鑒定應(yīng)當(dāng)依據(jù)菌落形態(tài)和有關(guān)生化鑒定。

目前國內(nèi)支原體檢測方法有固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法，血清學(xué)試驗(yàn)檢測法，分子生物學(xué)方法及支原體液體培養(yǎng)法等。

4.1 支原體固體培養(yǎng)法：固體培養(yǎng)法是標(biāo)準(zhǔn)的支原體培養(yǎng)法，固體培養(yǎng)基中加有馬血清、0.05%新鮮酵母浸膏、0.02%酚紅和抗生素。將接種好標(biāo)本的固體培養(yǎng)基置95%N2和5%CO2環(huán)境，35℃溫箱16－24小時(shí)培養(yǎng)形成細(xì)小典型的“荷包蛋”狀菌落。固體培養(yǎng)方法好，特異性高，但需要培養(yǎng)條件高，受局限性，培養(yǎng)基配制繁瑣，生長慢，采用濾膜易受污染［15］，同時(shí)存在所需配套設(shè)備多，技術(shù)要求高等缺點(diǎn)不利于臨床推廣。此方法廣泛應(yīng)用于研究所、實(shí)驗(yàn)室。目前國內(nèi)有條件的實(shí)驗(yàn)室已用法國生物梅里埃A7瓊脂平板固體培養(yǎng)基檢測支原體。

4.2 血清血試驗(yàn)診斷：包括：①斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)。②間接血凝試驗(yàn)（IHA）。③代謝試驗(yàn)（MIT）。④酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELASA）。斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)，此方法簡單，但敏感度低，可能漏檢；間接血凝試驗(yàn)（IHA）、代謝試驗(yàn)（MIT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等三種方法有較強(qiáng)的敏感性，缺點(diǎn)是操作較繁瑣費(fèi)時(shí)，需要大量血清，結(jié)果不穩(wěn)定，試劑不易獲得。

4.3 分子生物學(xué)方法：解脲支原體檢測的分子生物學(xué)方法包括：①聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。②熒光PCR（FQ－PCR）。PCR用于檢測解脲支原體DNA，具有可定性和定量、敏感度高、結(jié)果比較客觀的優(yōu)點(diǎn)，但無法提供藥敏試驗(yàn)，易受其他因素影響，穩(wěn)定性和特異性不足，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施要求高；熒光PCR（FQ－PCR）技術(shù)特異性和敏感性菌較高，亦存在一定假陽性，需要熒光定量測定儀，價(jià)格高，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求高，一般臨床實(shí)驗(yàn)室開展有一定難度。支原體培養(yǎng)法與PCR、FQ－PCR檢測結(jié)果對(duì)比：支原體培養(yǎng)法的特異性100%，但敏感性低，只有71.43%；PCR的敏感性為96.43%，但特異性稍不足，為93.7%；FQ－PCR的敏感性是三種方法中最高的99.2%，特異性為99.2%。FQ－PCR技術(shù)融合了PCR的高敏感性、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好；試驗(yàn)周期快，且能準(zhǔn)確定量，對(duì)早期診斷及療效的檢測有一定臨床價(jià)值，但PCR和FQ－PCR檢測需要特殊儀器和專業(yè)工作人員，較難在基層推廣。

4.4 支原體培養(yǎng)液法：目前國內(nèi)醫(yī)院臨床試驗(yàn)普遍采用支原體液體培養(yǎng)基進(jìn)行分離和鑒定，支原體在液體中生長具有與細(xì)菌不同的特點(diǎn)。該檢驗(yàn)方法簡單，快捷，經(jīng)濟(jì)，敏感性好。其檢驗(yàn)原理是依據(jù)解脲支原體能分解尿素，人型支原體能分解精氨酸，均能產(chǎn)氨使液體培養(yǎng)基變堿性。所有商品化中成品支原體培養(yǎng)液肉湯都依據(jù)此原理設(shè)計(jì)，在肉湯中加入酚紅指示劑，當(dāng)尿素或精氨酸被分解成NH3時(shí)肉湯PH值上升，含酚紅指示劑肉湯由橘黃色變紅色判斷為Uu和MH陽性［16］。但結(jié)果易受其他因素干擾，如標(biāo)本污染產(chǎn)尿酶細(xì)菌就會(huì)產(chǎn)生假陽性。常規(guī)支原體液體培養(yǎng)液中的抑制劑為青霉素，以抑制標(biāo)本中雜菌，但抑制劑不能抑制所有微生物。一旦有其他能分解尿素和精氨酸的微生物在培養(yǎng)基中生長，就會(huì)導(dǎo)致假陽性或假陰性，僅靠肉湯顏色變化判斷支原體陽性，不客觀，肉湯顏色變化只是一種提示和初篩。在檢測標(biāo)本中如果有較高比例的細(xì)菌生長，肉湯變渾濁或消耗肉湯中營養(yǎng)成分，造成假陽性和假陰性，影響結(jié)果的真實(shí)性［17］。建議有條件實(shí)驗(yàn)室檢測解脲支原體和人型支原體，以觀察肉湯顏色變化和支原體同時(shí)固體培養(yǎng)鑒定最佳。

綜上所述，F(xiàn)Q－PCR是一種比較理想的支原體檢測方法，優(yōu)于支原體液體培養(yǎng)法，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值和推廣價(jià)值。FQ－PCR法特異性好，敏感性好，而且能準(zhǔn)確定值，近年來特別在診斷新生兒痰液中解脲支原體的臨床意義較大，可觀察新生兒解脲支原體感染高低值，對(duì)診斷新生兒解脲支原體感染有臨床指導(dǎo)意義，但不能同時(shí)檢測支原體體外藥物敏感性，而且檢測設(shè)備要求高，基層難推廣。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法被普遍認(rèn)為是支原體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，目前無論是國外，還是國內(nèi)判斷支原體陽性的結(jié)論都是建立在固體培養(yǎng)基上的典型支原體菌落，該方法值得推廣。國內(nèi)目前已有用法國梅里埃A7瓊脂平板固體培養(yǎng)基法檢測支原體的有關(guān)報(bào)道，值得普及。液體培養(yǎng)法操作簡單，不要特殊條件，容易在基層普及推廣，結(jié)果容易判斷，可以同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，但容易受外界因素干擾，特異性較差，當(dāng)標(biāo)本混合有可分解脲酶的微生物液體培養(yǎng)基就會(huì)變紅產(chǎn)生假陽性和假陰性。至今沒有一種檢測技術(shù)的同時(shí)有100%的敏感性和特異性。建議醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室在采用支原體液體培養(yǎng)時(shí)，增加細(xì)菌分離鑒定及細(xì)菌脲酶試驗(yàn)，最好用固體培養(yǎng)法提高支原體的特異性，用液體培養(yǎng)法初篩并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，即可排除產(chǎn)脲酶細(xì)菌引起的假陽性，假陰性，又提高支原體培養(yǎng)的特異性和敏感性，保正結(jié)果準(zhǔn)性，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得臨床推廣應(yīng)用。

［1］ 張道友主編.先化臨床試驗(yàn)正常值手冊(cè)［M］.安徽科學(xué)技術(shù)出版社，2001：405

［2］ 王矽，宋新麗，李澤，等.泌尿生殖道感染支原體耐藥分析［J］.中華微生物和免疫學(xué)雜志，2002，22（4）：405－406

［3］ 李躍進(jìn)，譚湘芳.熒光定量PCR檢測性病的結(jié)果分析［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，6（14）：2151

［4］ 張子平，施透明，劉 等.非淋菌性尿道（宮頸）泌患者解脲支原體和人型支原體的培養(yǎng)分析［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，.34（2）：183－184

［5］ 王莉平，資捷，易輝.女性泌尿生殖道感染患者解脲支原體和人型支原體培養(yǎng)及耐菌性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，31（5）：612－614