RNAi在大腸癌基因治療中的研究現(xiàn)狀

陶亮，茆家定綜述，吳佩審校

(蕪湖市皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院胃腸二科，安徽蕪湖 241000)

目前大腸癌 (colorectal cancer)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年增高趨勢。大腸癌的發(fā)病過程是多步驟、多階段的，受遺傳和內(nèi)外環(huán)境等因素的作用［1］。傳統(tǒng)治療方法是以手術(shù)治療為主，同時輔以化療、放療的治療方案，雖然對Ⅰ期和Ⅱ期大腸癌有一定療效，但仍有大量的患者失去手術(shù)機會，而術(shù)后化療和放療對腫瘤非特異性，且敏感性差，副作用大，效果欠佳。因此迫切需要尋找到一條特異性高的診斷方法和有效的治療途徑。RNAi是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，是由外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細胞而引起同源的mRNA降解，進而抑制其相應(yīng)的基因表達。它具有特異、高效等突出優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛用于大腸癌基因治療方面的研究與探索。

1 RNAi概述

在1998年，美國學(xué)者Fire A等研究人員向線蟲體內(nèi)注入由正義鏈和反義鏈混合的dsRNA，出現(xiàn)了基因沉默現(xiàn)象(gene silencing)，隨后Fire將這一系列特異性基因沉默現(xiàn)象稱之為RNAi。過去十幾年間學(xué)者們發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象廣泛地存在于真核細胞中［2］。RNAi小分子也由最初的雙鏈RNAi，發(fā)展到現(xiàn)今的Small interfering RNA(siRNA)、Short hairpinRNA(shRNA)、piwi－interating RNA(piRNA)、Micro RNA(miRNA)等。RNAi的出現(xiàn)為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供了新的思路及方法，并用于某些腫瘤、病毒感染性疾病治療的研究中［3］。

1.1 RNAi的作用的基本原理 RNAi的作用機制尚未明確，目前普遍認為RNAi可分為兩個階段:

起始階段:當(dāng)病毒基因等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并利用該基因組進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生少許dsRNA及shRNA，再經(jīng)RNaseⅢ家族的 Dicer核酸內(nèi)切酶切割成長度為20－25bp的siRNA，siRNA被RNA解旋酶解鏈成正義鏈和反義鏈，其中的反義鏈與相關(guān)酶 (包括外切酶等)結(jié)合后形成RNA沉默的復(fù)合物 (RNA induced silencing complex，RISC)。

效應(yīng)階段:隨后攜帶siRNA反義鏈的RISC與目的基因的mRNA的互補序列特異性結(jié)合并切割結(jié)合部位兩端mRNA，斷裂的mRNA隨即降解，從而導(dǎo)致特定基因沉默。另外細胞基因組本身所產(chǎn)生的miRNA，經(jīng)一系列酶 (如Dicer酶、聚合酶等)作用后與相應(yīng)的靶mRNA結(jié)合，抑制其翻譯，從而抑制基因表達［4－5］。

1.2 RNAi的特點 RNAi具有以下幾個點特點:(1)特異性:siRNA的反義鏈與對應(yīng)基因mRNA互補配對，堿基序列具有高度的特異性;(2)高效性:僅需少量的dsRNA以催化放大方式產(chǎn)生大量的siRNA，從而有效抑制靶基因的表達;(3)長度依賴性:長鏈dsRNA也在細胞內(nèi)被Dicer酶切割為21個bp左右的siRNA，并由siRNA來介導(dǎo)mRNA切割;(4)可傳播性:siRNA可在RNA依賴性RNA酶(RdRP)的作用下大量擴增，并轉(zhuǎn)運出細胞，在不同細胞問長距離傳遞和維持，使RNAi擴散到整個機體并可以傳代;(5)ATP依賴性:siRNA整個作用過程中有酶參與的步驟均消耗ATP，在去除ATP的樣品中RNAi現(xiàn)象降低或消失［6－7］。

2 RNAi在大腸癌診療中的研究

2.1 RNAi在大腸癌細胞增殖的研究 大腸癌的發(fā)生過程是多步驟、多階段的，主要與人體內(nèi)抗凋亡基因的異常激活等因素有關(guān)。而抗凋亡基因的激活可導(dǎo)致凋亡抑制蛋白的高表達，從而抑制腫瘤細胞的增長。而RNAi可特異性的抑制某些基因的表達，所以利用RNAi封閉那些和大腸癌有關(guān)的基因從而抑制大腸癌細胞的生長，達到治療大腸癌的目的。

凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosisprotein，IAP)家族為一類抗凋亡基因表達產(chǎn)物，其中人體凋亡抑制蛋白是抑制細胞凋亡的重要成分，這一蛋白家族抑制細胞凋亡的作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，目前該家族已發(fā)現(xiàn)有Survivin、Livin等重要成員［8］。研究表明Survivin基因是人們認識的最強凋亡抑制基因，該基因只在腫瘤組織中表達，而在正常分化的組織中幾乎無表達［9］。Gazouli發(fā)現(xiàn)Survivin基因在大腸癌組織中高表達，其下游蛋白能抑制大腸癌細胞凋亡，促進大腸癌細胞的增殖［10］。Wang等通過通過cDNA技術(shù)構(gòu)建Survivin的shRNA并轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸癌SW480細胞，Western blot檢測細胞內(nèi)Survivin蛋白的表達水平降低，檢測實驗組細胞生長速度減慢多停滯于G2/M期［11］。Livin亦為IAP家族的一員，同樣在大腸癌組織中高度表達，在正常組織中幾乎無表達［12］。Bo－Young等構(gòu)建Livin的siRNA載體轉(zhuǎn)染至大腸癌細胞，并使用RT－PCR檢測大腸癌細胞mRNA水平變化，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染siRNA組大腸癌細胞生長明顯抑制，凋亡率顯著增加，RT－PCR顯示Livin mRNA表達顯著低于對照組［13］。STATs尤其是STAT3在多種腫瘸中表達均明顯增高，其表達強度與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等有關(guān)。STAT3被激活后可抑制免疫細胞對機體腫瘤細胞的監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤細胞的異常增殖［14］。尼克酰胺－N－甲基化酶 (NNMT)是近來研究發(fā)現(xiàn)，其與多種腫瘤關(guān)系密切，在結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中存在高表達［15］，NNMT的高表達則受到STAT3等因子激活。Bedel通過構(gòu)建了siRNA－STAT3轉(zhuǎn)染至大腸癌細胞HT－29中，使得NNMT表達受到抑制從而誘發(fā)了腫瘤細胞的凋亡［16］。研究發(fā)c－FLIP在抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用［17］。Shen等構(gòu)建了pFLAG－CMV－FLIP質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌HT－29細胞，可顯著降低FLIP基因mRNA的表達水平，并提高HT－29細胞對Fas介導(dǎo)的凋亡敏感性［18］。利用RNAi技術(shù)沉默上述有關(guān)凋亡抑制蛋白的基因，抑制大腸癌細胞的增殖，促進大腸癌細胞的凋亡，可能成為治療大腸癌基因治療的新方向，并且上述基因在腫瘤中高表達，而在正常組織中幾乎不表達，這種特異性可能會成為往后腫瘤診斷的新方法。

國外研究臨床研究證實長期服用非甾體抗炎藥(NSAIDs)能降低大腸癌的發(fā)生率［19］。隨后研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶－2(COX－2)在炎性介質(zhì)、生長因子等刺激啊下表達，而COX－2的產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)能夠刺激腫瘤的生長，抑制腫瘤細胞凋亡［20］。并有學(xué)者證實COX－2的表達與大腸癌細胞的增殖，腫瘤分期密切相關(guān)［21］。將COX－2抑制劑與常規(guī)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于大腸癌的治療中取得了不錯的效果［22］，但是隨后人們發(fā)現(xiàn)COX－2抑制劑的副作用會造成患者心腦血管病變，學(xué)者開始尋找高效、低毒的途徑抑制COX－2的表達。Sansone等通過瞬時轉(zhuǎn)染特異性siRNA后干擾大腸癌細胞HT－29中COX－2變化，隨后通過MTT和流式細胞分析儀檢測實驗組細胞增殖活性明顯受抑制，細胞生長明顯減緩，RT－PCR檢測實驗組mRNA水平較對照組明顯下降［23］。利用RNAi技術(shù)特異性抑制大腸癌細胞中的COX－2，可能給大腸癌基因治療提供新的靶點。

2.2 RNAi在抑制大腸癌細胞的侵襲 粘著斑激酶 (focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)作為胞內(nèi)重要的信號分子，介導(dǎo)細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的交聯(lián)，在大腸癌細胞的移動和侵襲中起關(guān)鍵的作用［24］。Shahzad構(gòu)建 FAK siRNA并應(yīng)用納米rHDL轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT116細胞，F(xiàn)AK干擾組較未處理組及陰性對照組FAK的表達明顯降低，干擾組細胞生長抑制 (P＜0.05)［25］。黏附分子CD44與纖維蛋白等結(jié)合，介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)間特異性黏附過程，與大腸癌的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，一定程度上促進了大腸癌的轉(zhuǎn)移［26］。Subramaniam等用siRNA下調(diào)結(jié)腸癌HT－29細胞CD44表達水平，能夠增加肌動蛋白結(jié)合蛋白的表達水平，從而改變結(jié)腸癌細胞的定向運動，阻止腫瘤侵襲［27］。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是腫瘤血管及淋巴管生成過程中作用最強的調(diào)控因子，它能刺激內(nèi)皮細胞增殖并阻止新生管腔退化，新生的血管及淋巴管有利于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，影響腫瘤的預(yù)后［28］。已有研究表明VEGF在大腸癌組織中較癌旁及正常組織中表達明顯增高［29］。YU構(gòu)建siRNA－VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸癌細胞株HT116后，靶基因VEGFmRNA表達下降，同時相關(guān)蛋白減少，從而抑制了大腸癌細胞的增殖活性，誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡，同時腫瘤細胞的侵襲特性降低［30］。

因此，在大腸癌的治療中，F(xiàn)AK、CD44、VEGF可以成為有效的基因治療靶點，以及作為預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，為進一步研究利用RNAi技術(shù)抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移奠定了一定的理論基礎(chǔ)，為腫瘤分子生物學(xué)治療提供了新思路。

3 結(jié) 論

RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其分子生物學(xué)機制和功能的初步闡明，為各種疾病的基因治療提供了理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于大腸癌的發(fā)病機制及基因治療的研究中，但目前仍限于體外實驗和動物實驗研究階段，作為有效的基因治療方法應(yīng)用于臨床還需要繼續(xù)深入的研究。RNAi在尋找對抗大腸癌轉(zhuǎn)移的途徑，探尋遺傳性大腸癌的基因缺陷及研究大腸癌的腫瘤疫苗等方面還有進一步探索研究的空間。因此，RNAi技術(shù)隱藏著巨大的應(yīng)用前景，值得進一步研究和探索。

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