sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的作用

劉珊 陳波 李燕 趙衛(wèi)紅 吳劍卿

CD40分子屬于腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis family receptor, TNFR）超家族成員。CD40及其配體CD40L（CD154）形成的共刺激信號(hào)在體內(nèi)免疫激活過(guò)程中起著核心作用。除了免疫細(xì)胞外，CD40還表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞。研究證實(shí)，CD40信號(hào)的活化在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用。有關(guān)激發(fā)型CD40單抗的臨床試驗(yàn)已初步顯示一定的作用。CD40相關(guān)的治療已成為腫瘤免疫治療和基因治療的發(fā)展方向之一[1-4]。

近年來(lái)研究[5-9]發(fā)現(xiàn)，CD40信號(hào)可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，且在不同的腫瘤類(lèi)型、細(xì)胞系及藥物間表現(xiàn)出一定的差異，但具體機(jī)制不明。關(guān)于CD40信號(hào)對(duì)肺癌細(xì)胞化療敏感性的影響鮮有報(bào)道，本研究旨在觀察可溶性CD40配體（sCD40L）聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱（vinorelbine）對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清（FCS）為杭州四季青公司產(chǎn)品，PE標(biāo)記鼠抗人CD40單克隆抗體、鼠抗人IgG1同型對(duì)照抗體及sCD40L均為Peprotech公司產(chǎn)品，四氮唑鹽（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司。長(zhǎng)春瑞濱為江蘇豪森藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。EP ICS XL型流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品，550酶標(biāo)儀為美國(guó)Biorad公司產(chǎn)品，生物倒置顯微鏡為Olympus CKX4。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置于含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37oC、5%CO2溫箱培養(yǎng)，4 d-5 d傳代1次。每次實(shí)驗(yàn)前取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后備用。

1.2.2 細(xì)胞表面CD40表達(dá)的檢測(cè) 取A549細(xì)胞3×105個(gè)細(xì)胞與CD40單抗及相應(yīng)的同型對(duì)照小鼠IgG在4oC孵育30 min。用含0.25% FCS和0.01% NaN3的PBS緩沖液洗滌2次后，重懸細(xì)胞并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD40的表達(dá)。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）加入96孔培養(yǎng)板中，加入CD40L（2 μg/mL），用含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整培養(yǎng)體積為100 μL，置溫箱中培養(yǎng)72 h后更換培養(yǎng)基并加入長(zhǎng)春瑞濱（20 μg/mL），每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白調(diào)零組、細(xì)胞對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，培養(yǎng)終止后，棄去上清液，鹽酸異丙醇（每孔100 μL）徹底溶解甲瓚顆粒，酶標(biāo)儀570 nm處讀取吸光度（A）值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組平均A值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞（5×104個(gè)/孔) 加入24孔培養(yǎng)板中，加CD40L（0.2 μg/mL, 1.0 μg/mL, 2.0 μg/mL），用含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整培養(yǎng)體積為1 mL，置溫箱中培養(yǎng)72 h后更換培養(yǎng)基并加入長(zhǎng)春瑞濱（20 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，共同預(yù)冷的PBS洗2次，加入75%乙醇，-20oC固定過(guò)夜。細(xì)胞離心后PBS洗1次，加入RNA酶（1 mg/mL）、PI（10 μg/mL）溶液、0.5% TritonX-100，室溫避光溫育30 min，加PBS，EPICS XL流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Caspase-3活性的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺腺癌細(xì)胞A549，制成1×106個(gè)/L的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，加CD40L（2.0 μg/mL），用含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整培養(yǎng)體積為1 mL，置溫箱中培養(yǎng)72 h后更換培養(yǎng)基并加入長(zhǎng)春瑞濱（20 μg/mL），同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、sCD40L和長(zhǎng)春瑞濱單獨(dú)作用組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS洗滌細(xì)胞2次（離心2 000 rpm，5 min）收集3×106個(gè)-5×106個(gè)細(xì)胞，按照Caspase-3檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)一步操作，酶標(biāo)儀λ=405 nm測(cè)定其吸光值。通過(guò)計(jì)算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定凋亡誘導(dǎo)劑組Caspase-3活化程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用Stata 7.0軟件，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 A549細(xì)胞表面CD40分子的表達(dá)率為（48.1±6.2）%。顯微鏡下見(jiàn)sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱有最佳的抗A549細(xì)胞作用（圖1）。MTT比色法結(jié)果顯示，sCD40L可抑制A549細(xì)胞的體外增殖（P＜0.05）；經(jīng)sCD40L預(yù)處理后，長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率上調(diào)（ P＜0.05）（表1）。

2.2 sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響 相同長(zhǎng)春瑞濱劑量下，sCD40L預(yù)處理與否對(duì)A549細(xì)胞周期時(shí)相影響不大，周期各時(shí)相的百分率無(wú)明顯變化（P＞0.05）；sCD40L預(yù)處理后并不顯著增加長(zhǎng)春瑞濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率（P＞0.05）。在各組間，細(xì)胞周期各時(shí)相的百分率及凋亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2，圖3）。

2.3 sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱對(duì)Caspase-3活性的影響 sCD40L單獨(dú)作用對(duì)A549細(xì)胞的Caspase-3活性無(wú)明顯影響；相同的長(zhǎng)春瑞濱劑量下，經(jīng)sCD40L預(yù)處理后的A549較未激發(fā)組細(xì)胞的Caspase-3活性顯著下降（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

圖 1 CD40激發(fā)前后長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞作用的鏡下觀察。A、B、C、D：分別為各組中所觀察的一個(gè)有代表性的視野。長(zhǎng)春瑞濱可導(dǎo)致細(xì)胞變小、變圓、脫壁、存活細(xì)胞明顯減少，其中以sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱組最顯著。A：空白對(duì)照組；B：sCD40L組；C：長(zhǎng)春瑞濱組；D：sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱組。Fig 1 Effect of sCD40L combined with vinorelbine on the proliferation of A549 cells observed by microscope. A, B, C or D showed a representative microscope field. The number of survival cells was obviously reduced when vinorelbine was added accompanied shrinking of the cell volume, emerging of a spherical shape and falling off of cells from the culture capsule wall, and this phenomena was most obvious in the group of sCD40L combined with vinorelbine. A: blank; B: sCD40L; C: vinorelbine; D: sCD40L+vinorelbine.

圖 2 CD40激發(fā)前后長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549凋亡率及細(xì)胞周期的影響（*3個(gè)sCD40L濃度所得結(jié)果的Mean±SD，與長(zhǎng)春瑞濱單藥組比較，P＞0.05）Fig 2 Effect of sCD40L combined with vinorelbine on the cell cycle and apoptosis of A549 cells (*Mean values of the results of three sCD40L concentration groups, sCD40L+vinorelbine vs vinorelbine alone, P＞0.05).

圖 3 PI染色細(xì)胞周期及凋亡情況測(cè)定Fig 3 Cells were analyzed for different phases and apoptotic rates by PI staining

圖 4 CD40激發(fā)前后長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞中Caspase-3活性的影響Fig 4 Effect of sCD40L combined with vinorelbine on the Caspase-3 activity of A549 cells (%, n=3, Mean±SD)sCD40L+vinorelbine vs vinorelbine alone, *P＜0.05.

表 1 CD40激發(fā)前后長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用 (n=3, Mean±SD)Tab 1 Effect of sCD40L combined with vinorelbine on the proliferation of A549 cells (n=3, Mean±SD)

目前，關(guān)于CD40信號(hào)通路在惡性腫瘤中的生物學(xué)作用存在不同意見(jiàn)。一方面，盡管大量研究證實(shí)激活CD40信號(hào)可抑制多種血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞及乳腺癌、大腸癌和肺癌等實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖，但也有CD40通路是腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)的報(bào)道[1]。另一方面，一些研究發(fā)現(xiàn)激活CD40信號(hào)可增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，而另一些研究報(bào)道CD40通路與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)[5-9]。這些矛盾的結(jié)論可能源于以下原因：不同腫瘤類(lèi)型間固有的差異；同種腫瘤中來(lái)源不同的細(xì)胞株；藥物作用機(jī)制不同產(chǎn)生的差異；未知的影響因素；激活CD40信號(hào)所使用方法的不同，這也是最顯著的原因，例如研究發(fā)現(xiàn)sCD40L和激發(fā)性CD40單抗（agonist）單獨(dú)作用并不顯著增加腫瘤細(xì)胞凋亡，除非細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成被某些化療藥物所抑制；而由細(xì)胞表達(dá)的膜型CD40L有明顯的促凋亡作用，但卻可能抑制化療藥物引起的凋亡[10-13]。鑒于CD40信號(hào)相關(guān)生物學(xué)作用的復(fù)雜性，有必要針對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)一步深入研究。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)sCD40L對(duì)CD40的激活可以顯著增強(qiáng)長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞的作用，進(jìn)一步研究提示其作用機(jī)制與促凋亡無(wú)關(guān)。但有關(guān)其它腫瘤細(xì)胞的研究中，CD40信號(hào)與凋亡的關(guān)系被認(rèn)為是其影響藥物敏感性的核心機(jī)制，激發(fā)CD40信號(hào)可能促進(jìn)凋亡也可能抑制凋亡[5,7,8]。王天立等[9]發(fā)現(xiàn)激發(fā)CD40信號(hào)可使順鉑（DDP）或絲裂霉素（MMC）誘導(dǎo)的非凋亡性細(xì)胞死亡顯著增加。李旭鹿等[14]發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮（soybean isof l avone, SIF）對(duì)長(zhǎng)春瑞濱有增效作用，但也與誘導(dǎo)凋亡無(wú)關(guān)，細(xì)胞為變性樣改變。付校等[15]發(fā)現(xiàn)自噬在長(zhǎng)春瑞濱誘導(dǎo)的A549細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)sCD40L聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱較單用長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞周期時(shí)相影響不大，排除了CD40信號(hào)通過(guò)抑制細(xì)胞周期而達(dá)到增效的可能。因此，我們推測(cè)sCD40L的藥物增敏作用可能與其它細(xì)胞死亡或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制機(jī)制有關(guān)。

長(zhǎng)期以來(lái)，誘導(dǎo)凋亡被認(rèn)為是化療藥物殺滅腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制，但越來(lái)越多的證據(jù)[16-20]顯示，其它如自噬（autophagy）、凋亡樣或壞死樣程序性死亡（apoptosis-like and necrosis-like programmed cell death）、有絲分裂災(zāi)難（mitotic catastrophe）以及加速的細(xì)胞老化（senescence）等廣泛參與了化療藥物的治療作用。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能，其活性在凋亡發(fā)生時(shí)常明顯升高[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管sCD40L并不明顯影響藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但Caspase-3的活性卻意外地顯著下降。Voorzanger-Rousselot等[7]在乳腺癌細(xì)胞系中的研究有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)：CD40信號(hào)的激活可顯著抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但Caspase-3/7的活性反而增加2倍-4倍，表明Caspase的活性與細(xì)胞凋亡不存在固定的因果關(guān)系，可能有其它調(diào)節(jié)機(jī)制。此外，Caspase-3的活性在胞膜不完整的死亡細(xì)胞中通常是明顯下降的[21]，這也進(jìn)一步提示本研究中sCD40L的增敏作用可能以誘導(dǎo)非凋亡性細(xì)胞死亡為主。這些死亡機(jī)制均是Caspase非依賴(lài)性的，可能與Cathepsins及Calpains等蛋白酶有關(guān)，并且廣泛存在于以微管為靶點(diǎn)的藥物作用中[22,23]。

綜上，本研究提示sCD40L對(duì)CD40信號(hào)的活化可能通過(guò)凋亡及細(xì)胞周期抑制以外的機(jī)制影響長(zhǎng)春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞的作用。未來(lái)的研究應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在機(jī)制，并找出可行的調(diào)節(jié)方法。