椎間盤退變基因治療進展

胡有谷 陳伯華

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科山東省創(chuàng)傷骨科研究所，青島266003）

椎間盤退變是導(dǎo)致腰背痛的病理生理學(xué)原因之一。多年來，對椎間盤細(xì)胞、生化特性以及微環(huán)境的研究，發(fā)現(xiàn)椎間盤退變時呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞數(shù)減少、重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和Ⅱ型膠原降低和基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加等。因此，20世紀(jì)90年代后期許多學(xué)者開始研究新的治療方法，即椎間盤退變的生物學(xué)治療。生物學(xué)治療包括細(xì)胞治療、基因治療和椎間盤組織工程。當(dāng)前以基因治療最具期待用于椎間盤退變的臨床治療方法。

基因治療基于將外源性基因DNA或RNA轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，引起外源基因表達并對靶細(xì)胞降低或缺乏的有利的蛋白質(zhì)合成,恢復(fù)靶細(xì)胞的正常功能和形態(tài)7年日本Nishida[1]首先開展了椎間盤退變基因治療實驗研究。山東省創(chuàng)傷骨科研究所自1999年至今進行椎間盤退變基因治療研究工作。椎間盤退變基因治療實驗研究程序為靶細(xì)胞的確定、目的基因的選擇、載體的選擇、基因的表達以及轉(zhuǎn)基因后生物學(xué)效應(yīng)的驗證。

椎間盤退變基因治療10余年的研究結(jié)果顯示：①髓核中軟骨細(xì)胞可選作為靶細(xì)胞，而纖維環(huán)中纖維細(xì)胞在正向調(diào)控基因作用下并不能增加細(xì)胞外基質(zhì)。②確定某些外源性生長因子基因轉(zhuǎn)染的表達，可上調(diào)合成細(xì)胞外基質(zhì)。例如TGF家族，其中TGF-β1和TGF-β3在體內(nèi)、外試驗中均能有效增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達。③腺病毒和腺相關(guān)病毒為最有效的轉(zhuǎn)染基因載體，可將轉(zhuǎn)染的目的基因片段導(dǎo)入到靶細(xì)胞，達到目的基因與靶細(xì)胞的整合，使基因片段循環(huán)表達并在原位一定時期合成目的蛋白。腺相關(guān)病毒它能轉(zhuǎn)染至多種組織細(xì)胞，對人類無致病性和很輕微的免疫反應(yīng)并使目的基因較長期表達。④觀察椎間盤基因治療體內(nèi)試驗效果，以靈長類動物恒河猴椎間盤退變模型評價基因轉(zhuǎn)染后生物學(xué)效應(yīng)為宜。經(jīng)過10余年上述研究證實，基因治療可能成為一種延緩和逆轉(zhuǎn)的有效方法。然而，椎間盤退變基因治療尚存在期望轉(zhuǎn)染目的基因長期表達的要求,目前體內(nèi)試驗示椎間盤內(nèi)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的含量增加能持續(xù)達26周。此外，病毒類載體的安全性尚待確定和基因表達的調(diào)控等尚待解決。因此由實驗研究進入到臨床應(yīng)用尚有距離。

在上述椎間盤退變基因治療取得成績的基礎(chǔ)上，該課題己成為脊柱外科基礎(chǔ)研究重點之一。依據(jù)近年來國內(nèi)、外相關(guān)文獻和本所研究的工作，在椎間盤退變基因治療又取得以下新的進展。

1 目的基因的應(yīng)用趨向

1.1 細(xì)胞因子的選擇

用于椎間盤退變基因治療的細(xì)胞因子分為4類：①抗分解代謝細(xì)胞因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）和白細(xì)胞介素l（interleukin，IL-I）受體拮抗劑[4,5]。②促細(xì)胞分裂素，如胰島素生長因子（insulin-like growth factor-1,IGF-1）、生長分化因子5（growth and differential factor 5，GDF-5）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF）等[6-9]。③骨誘導(dǎo)形成素，如轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-beta,TGF-β家族）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP家族）[2,10]。④細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子如骨誘導(dǎo)蛋白I（LIM mineralization protein-l，LMP-1）和 Sox-9 基 因[11,12]。上述細(xì)胞因子基因被用于正向調(diào)控的目的基因。

上述4類細(xì)胞因子為椎間盤退變基因治療所選1991年Thompson[2]首先證實外源性（TGF-β1）能上調(diào)狗的椎間盤組織培養(yǎng)中的蛋白多糖合成。1999年Nishida[2]首先開展椎間盤退變基因治療，體內(nèi)動物模型退變椎間盤證實應(yīng)用TGF-β能增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖合成7年Moon[3]首先體外基因轉(zhuǎn)染人椎間盤細(xì)胞。用的目的基因,目前尚無新入選的細(xì)胞因子。各類細(xì)胞因子對細(xì)胞外基質(zhì)影響不同[15]。TGF-β對蛋白多糖和Ⅱ型膠原均能發(fā)揮上調(diào)作用[13,14]，SOX9為轉(zhuǎn)換因子，其增加Ⅱ型膠原表達，體外試驗?zāi)茉黾尤俗甸g盤髓核細(xì)胞中重要細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原含量[15]。

1.2 多細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染

雙細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染：在2004年以前為單細(xì)胞因子目的基因應(yīng)用7年后從事多細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染。本研究所2004年后進行了雙細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染退變椎間盤TGF-β1和VEGF，TGF-β1和TGF-β3。另為其中一為正向調(diào)控細(xì)胞因子TGF-β1和另一為MMP抑制因子TIMP-1。雙正向調(diào)控細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染退變椎間盤后生物學(xué)效應(yīng)優(yōu)于單細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的效果[16,17]。VEGF和TIMP-1能協(xié)助TGF-β家族上調(diào)椎間盤中基質(zhì)合成和代謝的平衡，但VEGF不能增加髓核細(xì)胞的基質(zhì)合成[18]。Leckie等[19]報導(dǎo)應(yīng)用AAV-BMP2和TIMP1體內(nèi)試驗顯示能延緩椎間盤退變。Haschtmann等[20]報告雙細(xì)胞因子作用的不同結(jié)果，其基因治療體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)BMP-2和TGF-β3不能阻止椎間盤退變。這表明TGF-β家族和BMP家族中不同的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)對退變椎間盤髓核細(xì)胞呈現(xiàn)不同的作用。

三細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染：2008年Moon和Nishida[22]提出基因治療多細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染，又稱為雞尾酒式治療性基因轉(zhuǎn)染（cocktail therapeutic gene transfer）。體外試驗以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染TGF-β1 gene（Ad/TGF-β 1），IGF-1 gene（Ad/IGF-1）BMP-2 gene(Ad/BMP-2)。18 h后測定細(xì)胞蛋白多糖含量。其結(jié)果上述3個細(xì)胞因子的單細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的蛋白多糖含量較對照組增高分別為 Ad/TGF-β 2.91倍，Ad/IGF-1 1.8倍，Ad/BMP-2 1.9倍。雙細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的蛋白多糖含量較對照組增高3.2～3.9倍。三細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的蛋白多糖含量較對照組增高4.7倍。此顯示三細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染均較單細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染和雙細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染后蛋白多糖含量為髙。此種多細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染方法可減少腺病毒用量，并防止全身和局部毒性作用和免疫反應(yīng)[21]。

本研究所2011年選用hTGF-β3、CTGF 和TIMP-1三細(xì)胞因子基因體外轉(zhuǎn)染,其結(jié)果顯示三細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染較雙細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染后細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖含量增高1.5倍。

1.3 協(xié)助細(xì)胞因子上調(diào)功能

除應(yīng)用細(xì)胞因子調(diào)控主要的細(xì)胞基質(zhì)外,亦可用合成肽Link N協(xié)助細(xì)胞因子增強上調(diào)功能。體內(nèi)實驗顯示注入Link N后，在髓核和纖維環(huán)內(nèi)聚集蛋白多糖基因表達明顯增加，而蛋白酶基因表達明顯下降，但不改變間盤DNA含量[22]。

細(xì)胞因子與細(xì)胞治療結(jié)合：以移植細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)染（cell-based gene delivery），此適用于嚴(yán)重椎間盤退變。移植細(xì)胞攜帶治療性細(xì)胞因子，此較轉(zhuǎn)基因方法安全。Zhang等[23]體外試驗髓核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng),后者過度表達的BMPs可刺激蛋白多糖和膠原的產(chǎn)生。

2 病毒類載體應(yīng)用進展

細(xì)胞的目的基因轉(zhuǎn)染需要通過載體,裸露的目的基因DNA不能被細(xì)胞所結(jié)合和表達，因而不能將目的基因直接導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。目的基因需要通過載體包裝，轉(zhuǎn)入、保護和攜帶基因序列至靶細(xì)胞，隨后獲得目的基因的表達。外源性基因真核表達載體分為非病毒類（naked deoxyribonucleic acid）和病毒類，前者非病毒類載體PCI己不應(yīng)用，后者病毒類載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒應(yīng)用較多[24]?？傊?，通過載體的選擇由非病毒類至逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的進程，其結(jié)果增強了目的基因感染細(xì)胞的成功率和加強了基因表達。但由于此類病毒的攜帶細(xì)胞因子目的基因容量有限、目的基因表達時間短和轉(zhuǎn)基因后的生物學(xué)效應(yīng)隨時間延長而下降，因而探尋新的基因轉(zhuǎn)染載體。

近年來其他疾病如神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病和血液病等基因治療，應(yīng)用慢病毒載體作為新的病毒類載體[25,26]。

2.1 慢病毒（lentiviral veccttoorr，LLVV）

慢病毒染色體組的載體其特點為可用于各種組織的靶細(xì)胞、能承載更多的基因載荷，可攜帶較大基因組、可將目的基因高效整合至基因組DNA而穩(wěn)定表達?？筛咝Ц腥痉至哑诩胺欠至哑诩?xì)胞，亦利于靶細(xì)胞的基因表達調(diào)節(jié)。慢病毒整合宿主細(xì)胞的染色質(zhì)，而不是優(yōu)先整合于轉(zhuǎn)切起始部位的近端,而發(fā)生易于插入基因表達富染色體區(qū)。慢病毒載體具有不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，從安全角度來說，能盡量減少RCV的產(chǎn)生，為復(fù)制缺陷型病毒載體，不會對細(xì)胞或人體產(chǎn)生不良污染，屬于低毒性病毒載體。慢病毒安全性明顯優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄病毒，亦優(yōu)于非病毒類基因載體[27-29]。慢病毒載體用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)的DNA顯微注射相比具有操作簡單、整合效率高、成本低廉等?；谶@些優(yōu)點，以其作為基因轉(zhuǎn)染體系的轉(zhuǎn)基因研究，在近年來得到了廣泛的開展。慢病毒染色體組的載體在8年前己用于臨床試驗和轉(zhuǎn)基因動物。慢病毒載體現(xiàn)己在動物模型中成功地用于治療各種基因缺陷性疾病和生理性疾病。臨床應(yīng)用前的研究結(jié)果顯示人類基因治療可應(yīng)用慢病毒載體的證據(jù)[30]。

當(dāng)前應(yīng)用的慢病毒主要為HIV，2008年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎授于3位研究人乳頭狀病毒和HIV病毒臨床科學(xué)家。Fran?oise Barré-Sinouss和Luc Montagnier為研究HIV作出貢獻。盡管對HIV己經(jīng)研究25年，但是至今尚無有效預(yù)防和治療效果的抗病毒疫苗。因而，感染HIV的艾滋?。╝cquired immunodeficiency syndrome,AIDS）仍然臨床無法治愈。然而對HIV結(jié)構(gòu)和生物學(xué)的了解和以HIV為載體的經(jīng)各種標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)測定，證實其安全性己有很大的進步。己認(rèn)為HIV病毒可作為安全性的轉(zhuǎn)基因載體，且較其它病毒類載體和非病毒類載體更適于轉(zhuǎn)染非分化、分化緩慢和靜止期的細(xì)胞。本研究所成功地分別應(yīng)用慢病毒HIV構(gòu)建人生存素survivin、TGF-b3 TIMP-1和慢病毒hTGF-β3、CTGF和TIMP-1構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染椎間盤[31]。

2.2 桿狀病毒（Baculovirus）

文獻中亦有報告桿狀病毒作為載體。桿狀病毒為一昆蟲病毒，在體內(nèi)或體外能釋放外源性基因至哺乳類動物細(xì)胞，包括不含細(xì)胞毒素末分化細(xì)胞。Liu等[32]報告桿狀病毒攜帶綠色瑩光蛋白（the green fluorescence protein gene，Ad-CMV-GFP），注入髓核內(nèi)，用瑩光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測基因表達.結(jié)果發(fā)現(xiàn)87%髓核細(xì)胞感染并證實。長期基因表達對細(xì)胞無毒性反應(yīng)。

3 基因治療新策略——基因表達調(diào)控

3.1 RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）

最近認(rèn)為RNAi技術(shù)能在椎間盤內(nèi)下調(diào)某些特殊基因表達，尤其是病理性基因表達調(diào)節(jié)，此為椎間盤基因治療開創(chuàng)了新的途徑,成為椎間盤退變基因治療另一策略[33]。RNAi是一種在轉(zhuǎn)錄水平高效阻抑基因表達的新方法，它通過導(dǎo)入一段與內(nèi)源性基因同源的雙鏈RNA序列（dsRNA），使內(nèi)源mRNA降解，從而達到阻止目的基因表達的目的[34]。RNAi干擾技術(shù)降低由小干擾RNA（siRNA）產(chǎn)生的靶基因產(chǎn)物，siRNA與靶基因的mRNA的特異序列結(jié)合，此既可抑制mRNA的翻譯又可增強mRNA的降解。因此，可將椎間盤組織細(xì)胞內(nèi)分解代謝基因作為靶基因并通過siRNA介導(dǎo)破壞，使分解代謝基因沉默阻止分解代謝基因翻譯。當(dāng)siRNA與治療性外源性基因結(jié)合時，其半衰期短。RNAi基因沉默和其他傳統(tǒng)方法相比的特點[35]：①高特異。最顯著特征是只引起與dsRNA同源的mRNA降解，而其他mRNA的表達不受影響。②高效性。顯著抑制基因表達甚至完全敲除每個細(xì)胞只需要幾個siRNA就能有效抑制靶基因表達。③可傳播性。siRNA具有強烈的跨越細(xì)胞界限的能力，能夠在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持，RNAi擴散到整個機體并可傳代。④可遺傳性。RNAi的基因沉默在低等動物中可遺傳。

近年來RNAi成功用于動物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因椎間盤退變模型。Kakutani等[36]體外椎間盤細(xì)胞和體內(nèi)椎間盤轉(zhuǎn)染含有兩種熒光素酶基因的質(zhì)粒和針對Firefly基因的siRNA以及針對細(xì)胞Fas蛋白配體的siRNA分子及非特異性siRNA分子。結(jié)果顯示體外實驗由siRNA介導(dǎo)的基因在小鼠髓核細(xì)胞中下調(diào)94.7%，在人髓核細(xì)胞中下調(diào)93.7%,體內(nèi)試驗特異性的基因沉默持續(xù)超過24周，而對照的基因表達未受影響。證實用DNA載體-siRNA復(fù)合物可獲得特殊靶基因表達的下調(diào)。Seki等[37]發(fā)現(xiàn)在退變椎間盤中存在蛋白溶解酶如金屬蛋白酶和ADAMTS家族（去整合素和含有血小板凝血酶樣的金屬蛋白酶的基因）。其在動物退變椎間盤模型中單次注射ADAMTS-5 siRNA和寡核苷酸，觀察椎間盤高度、MRI和椎間盤組織番紅-O染色、證實ADAMTS-5 siRNA可抑制髓核降解。此種椎間盤退變組織對siRNA反應(yīng)的機制可能具有治療價值。此外，Sudo等[38]報告用caspase 3 siRNA轉(zhuǎn)染髓核可明顯降低細(xì)胞凋亡，保存正常細(xì)胞外基質(zhì)。因此，RNAi機理適合于對椎間盤退變的MMPs和ILs細(xì)胞外基質(zhì)降解基因發(fā)揮基因沉默的作用，從而延緩或阻斷椎間盤退變。

3.2 基因表達系統(tǒng)調(diào)控

置入基因表達系統(tǒng)有熱休克蛋白（heat shock proteins,hsp）、金屬流基組氨酸基內(nèi)鹽（metallothionine）、激素調(diào)節(jié)啟動子（steroid regulatory promoters）、四環(huán)素和昆蟲蛻皮激素受體（insect ecdysone receptor）等方法。多數(shù)置入基因表達系統(tǒng)在載體結(jié)構(gòu)內(nèi)與治療基因活性標(biāo)志區(qū)相連，使基因表達“開”和“關(guān)”。熱休克蛋白基因的表達受溫度變化的影響。編碼hsp70基因的表達是在hsp70B啟動子的控制之下。該啟動子可與導(dǎo)人體內(nèi)的靶基因結(jié)合，通過提高局部溫度促進靶基因的表達。Tet-On系統(tǒng)為轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)在注入四環(huán)素后與AAV載體結(jié)構(gòu)結(jié)合。此系統(tǒng)己成功地顯示標(biāo)記基因的調(diào)節(jié)[39,40]。

4 椎間盤退變動物模型建立和觀察

椎間盤退變基因治療體內(nèi)實驗是為獲得過渡到臨床應(yīng)用的必備條件。其中椎間盤退變動物模型所選擇的動物己公認(rèn)為靈長類動物。退變椎間盤造模方法尚無確切的生理性椎盤退變方法，而目前通用的造模方法為椎間盤針刺損傷法。此法因穿剌針直徑不同而致椎間盤退變出現(xiàn)的時間和嚴(yán)重度不一。本研究所取恒河猴在CT引導(dǎo)下應(yīng)用20號針經(jīng)皮穿剌椎間盤進行退變椎間盤造模,獲得了早期椎間盤退變并延長了觀察時間[41]。

椎間盤退變基因治療體內(nèi)實驗研究需觀察生物學(xué)效應(yīng)。退變椎間盤轉(zhuǎn)目的基因后，應(yīng)定期作退變椎間盤和自身對照椎間盤兼或?qū)φ战M退變椎間盤的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖生物化學(xué)測定。為了取椎間盤組織，通常以動物處死方式，這使得動物用量增加和長期隨訪觀察受限。

當(dāng)前MRI設(shè)備己有3.0Tesla和7.0Tesla，MRI成像技術(shù)己進入稱為功能性磁共振成像技木，如磁共振彌散張量成像技術(shù)（Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging）、磁共振波譜成像技術(shù)(Magnetic Resonance Spectroscopic Imaging）、T1ρ值計算（T1ρ calculation）、T2弛豫時間測定（T2 relaxation time measurement）、磁共振彌散定量成像技術(shù)（diffusion quantitative imaging）和放射性核素成像技術(shù)（radio nucleotide imaging）。此種MRI成像技術(shù)是一種無創(chuàng)性獲得活體生理及病理物質(zhì)代謝的檢查方法，將影像學(xué)檢查深入到生物化學(xué)甚至基因水平，被稱為“虛擬活檢”[42,43]。這種無創(chuàng)性功能性磁共振成像技木對椎間盤組織生物化學(xué)測定，將明顯有利于椎間盤退變造模和基因治療體內(nèi)效果的系統(tǒng)性觀察。達到觀察椎間盤由正常至不同級別退變的進程和形態(tài)以及轉(zhuǎn)基因后退變級別和形態(tài)的變化。同時，為基因治療試驗應(yīng)用的有效性具備影像學(xué)和細(xì)胞基質(zhì)含量變化的客觀評價。

5 基因治療的安全性

在椎間盤退變基因治療過渡到臨床應(yīng)用前其安全性為最重要課題。椎間盤退變基因治療的技術(shù)基礎(chǔ)之一，是將由病毒作為載體攜帶正向調(diào)控的目的基因質(zhì)粒注入相對封閉無血液循環(huán)的椎間盤髓核內(nèi)。但若此基因質(zhì)粒注入椎間盤外進入血液循環(huán)或蛛網(wǎng)膜下腔將產(chǎn)生災(zāi)難性結(jié)果。Wallach等[44]報告Ad/TGF-β1意外地注入新西蘭大白兔蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi),造成癱瘓和嚴(yán)重的組織學(xué)改變。.若基因質(zhì)粒注入新西蘭大白兔硬膜外腔，其發(fā)生并發(fā)癥因載體而異。應(yīng)用腺病毒載體發(fā)生并發(fā)癥達80%以上，應(yīng)用腺相關(guān)病毒載體則無發(fā)生并發(fā)癥，表明腺相關(guān)病毒安全性高[45]。為了確定基因質(zhì)粒僅存在于靶椎間盤內(nèi)，Sowa等[46]介紹髓核細(xì)胞用AAV-RheoSwitch GFP增大感染倍率并用Intrexon's activator標(biāo)記物。，用瑩光顯微鏡和免疫組化染色檢測組織中綠色瑩光蛋白（green fluorescent protein，GFP)。發(fā)現(xiàn)GFP僅見于病毒載體，僅有病毒和Intrexon's activator標(biāo)記物，則在相鄰椎間盤和組織內(nèi)末見GFP。此方法可證實基因治療限局于靶細(xì)胞中，提高其安全性。此外，在一個質(zhì)粒上用有限的病毒載體量，載荷多個目的基因，增強轉(zhuǎn)基因表達，減少病毒載體的用量亦為提高基因治療安全性的方法。對于病毒類載體，尤其是談虎色變的HIV，盡管顯示其憂越性和安全性，仍需反復(fù)研究論證。

6 基因治療應(yīng)用前景

許多學(xué)者認(rèn)為基因治療是椎間盤退變生物學(xué)治療中最具希望的工具[47]?；蛑委煘橹铝τ诟淖兗?xì)胞基質(zhì)蛋白質(zhì)表達的理想方法[48]。實驗研究證實BMP-7亦即骨形成蛋白-1（OP-1）和BMP-14亦即生長分化因子-5能有效地恢復(fù)退椎間盤變的結(jié)構(gòu)。在此研究基礎(chǔ)上，美國FDA已將OP-1和GDF-5作為新藥臨床試驗[49]。

自1997年Nishida開創(chuàng)性地進行了退變椎間盤基因治療的研究工作至今16年取得了一定的成果，我們?nèi)詰?yīng)繼續(xù)深入研究椎間盤退變的病理生理學(xué)，治療基因的安全用量、基因表達所需持續(xù)的時間、治療性基因?qū)ψ甸g盤組織結(jié)構(gòu)和重建椎間盤生物力學(xué)影響等重要課題，以早日實現(xiàn)椎間盤退變基因治療的臨床應(yīng)用。

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