基于連續(xù)掃描方式的激光共焦掃描顯微鏡的研制＊

姜 曼，陶振強(qiáng)，蔣庭佳，賈南南，郭漢明

（上海理工大學(xué) 光電信息與計算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093）

引 言

激光共焦掃描顯微鏡（LCSM）廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域［1］，因其具有三維成像能力和良好的橫向分辨率和縱向分辨率［2－4］受到了廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)的掃描共焦顯微鏡，一般采用光束掃描式［5］，利用兩個相互垂直的平面掃描振鏡實現(xiàn)光學(xué)切片二維掃描［6］；然而，對于超大視場的成像，光束掃描方式由于在掃描過程中使光束發(fā)生偏轉(zhuǎn)，會在視場邊緣產(chǎn)生球差，引起視場邊緣成像與中心成像分辨率的不一致，從而容易導(dǎo)致光斑的空間輪廓形狀凹凸不平［7］。近年來，提出了一種采用數(shù)字微鏡器件的并行共焦檢測系統(tǒng)［8－10］提高成像速度的方法，但是在微透鏡陣列焦平面上得到的焦點是非均勻分布的，產(chǎn)生了一些畸變，與理想的焦點發(fā)生了位移。因此，采用工作臺運(yùn)動實現(xiàn)掃描，即激發(fā)光的會聚焦點靜止而載物臺進(jìn)行二維或三維運(yùn)動實現(xiàn)連續(xù)掃描。這種工作臺運(yùn)動掃描方式，優(yōu)點是在對超大視場的逐點掃描成像時，可以在整個視場區(qū)域?qū)崿F(xiàn)一致的高分辨率成像，缺點則是成像速度慢。

為了提高成像速度，本文對工作臺運(yùn)動掃描方式LCSM中傳統(tǒng)的多幀取平均的方法進(jìn)行了改進(jìn)，設(shè)計并實現(xiàn)了一種基于工作臺連續(xù)運(yùn)動的LCSM系統(tǒng)，并且提出了單幀成像濾除隨機(jī)噪聲的方法。

圖1 系統(tǒng)原理Fig.1 Principle diagram of the system

1 反射式LCSM的工作原理

圖1是設(shè)計的反射式LCSM系統(tǒng)原理圖，該系統(tǒng)主要由幾大模塊組成，包括：光學(xué)成像模塊、光電轉(zhuǎn)換及放大模塊、機(jī)械掃描模塊、數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理模塊。

其中光學(xué)成像模塊采用無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)，由于其系統(tǒng)中存在一段平行光路，在光學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計和像差矯正上具有一定的優(yōu)勢。入射光波為405nm的激光，該波長不僅不會殺傷細(xì)胞，而且滿足高分辨率的要求。采用共軛技術(shù)成像，使光源、被測樣品及探測器處于彼此對應(yīng)的共軛位置上。入射激光經(jīng)過分光鏡反射后聚焦到樣品的某點處，由該點激發(fā)出來的熒光透過顯微物鏡，光束經(jīng)過分光鏡與高通濾波器后，僅有熒光波段通過，熒光通過成像透鏡聚焦于針孔處，非焦平面上的雜散光被濾掉，通過針孔的熒光被光電倍增管接收，工作臺通過作三維掃描便可以完成對光學(xué)斷層成像。

2 影響LCSM分辨率的因素

2.1 針孔大小及取樣間隔的選擇

針孔的大小與愛里斑的直徑相關(guān)，許多人對LCSM的三維光學(xué)傳遞函數(shù)與探測器前方針孔直徑之間的關(guān)系進(jìn)行了研究［11－12］。結(jié)果表明［11］，該針孔直徑不必非常小。當(dāng)針孔直徑恰好等于一個愛里斑所成像的大小時，探測器接收到的光能量較高，既可以提高信噪比，又不會對分辨率造成特別大的影響。愛里斑經(jīng)過無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)放大后，其像的大小為：

其中，β為系統(tǒng)的放大倍率，λ為入射光波長，NA為數(shù)值孔徑。已知β＝40倍，λ＝405nm，NA＝0.95，根據(jù)式（1）計算得到愛里斑像的大小約為20μm。因此，該系統(tǒng)選用20μm針孔直徑。取樣間隔遵循的原理是奈奎斯特采樣定理，將愛里斑作為周期信號，能夠區(qū)分兩個愛里斑的取樣間隔為0.25個愛里斑直徑，將取樣間隔定位在100～125nm之間，即可滿足還原高分辨率圖像的要求。

2.2 數(shù)據(jù)分配消除隨機(jī)噪聲

隨機(jī)噪聲具有很寬的頻譜，若采用低通濾波，必然會造成圖像的高頻成分損失。傳統(tǒng)的做法是多幀平均，根據(jù)隨機(jī)噪聲互不相關(guān)的特點，且均值為零，可以有效的壓縮噪聲。具體的方法就是在被測實驗樣本熒光極弱的情況下可通過多幀平均的方法來提高信噪比。盡管納米位移臺的重復(fù)精度很高（小于5nm），但是多幀平均會使掃描時間成倍增加，為了在一次掃描時間內(nèi)完成濾除隨機(jī)噪聲的任務(wù)，提出了利用數(shù)據(jù)分配濾除隨機(jī)噪聲的方法，即在每一點附近采集多次，再將這些值累加或加權(quán)取平均得到該點的能量值。具體原理如下所述。

在任意時刻采集的數(shù)據(jù)為：

輸入數(shù)據(jù)的噪聲功率：σ2

在某一段時間內(nèi)，采集到的數(shù)據(jù)為：

當(dāng)采集卡的采樣率S→＋∞，且K為有限值時，t→0，相當(dāng)在極短的時間內(nèi)在某一點處取了K次，此時，輸出數(shù)據(jù)可以近似表示為：

噪聲的均值和方差分別為：

信噪比：

累加后的信噪比提高了K倍。

采集卡的型號是 NI－6120（12bit），采樣率單位為S／s，表示每秒鐘采集的次數(shù)。最高采樣率可以達(dá)到10 000 000S／s。當(dāng)采樣率足夠高時，可以近似認(rèn)為在一點處取得的平均值，就每一行而言，具體采集方法如圖2所示。

若采集范圍為50μm，需要500個像素，工作臺掃描速度為100μm／s，當(dāng)采樣率設(shè)置為1 000 000S／s時，每行可以得到500 000個點，取樣間隔為100nm，每個間隔內(nèi)有1 000個采集點可供分配，若將1 000個采集點都取平均，相當(dāng)于低通濾波器掩膜尺寸太大，導(dǎo)致細(xì)節(jié)被濾掉，圖像變得很平滑。為了避免這種情況，只取其中的前十分之一的數(shù)據(jù)，即100個采集點做加權(quán)平均，這100個采集點分布在10nm范圍內(nèi)，對分辨率不會造成影響。

圖2 采集方法Fig.2 Acquisition method

圖3 不同采樣率對比Fig.3 Comparison of different sampling rate

如圖3所示，兩幅圖均取了50次平均，圖3（a）的采樣率為10 000S／s；圖3（b）的采樣率為100 000S／s可以看出隨著采樣率的提高，平滑效果減弱。事實上，當(dāng)采樣率可以設(shè)置為10 000 000S／s時，取樣平均的次數(shù)也可以增加，使均值趨于零。利用這種方法有效地濾掉了隨機(jī)噪聲，同時還保留了圖像細(xì)節(jié)。

3 同步系統(tǒng)設(shè)計

3.1 同步采集方法研究

該系統(tǒng)選用PI公司的3軸壓電陶瓷驅(qū)動納米位移臺，型號是P－545，3個軸移動范圍均為200μm，由于具有長量程和型面不高的特點，非常容易整合進(jìn)高分辨率的顯微鏡內(nèi)，并且位移精度可以達(dá)到1nm，完全滿足高分辨成像的需要。

圖4 單向掃描Fig.4 The single－direction scanning

連續(xù)掃描是指工作臺可以從初始位置連續(xù)移動到目標(biāo)位置，同時采集卡不間斷的采集數(shù)據(jù)，因此，工作臺與采集卡實現(xiàn)同步尤為重要。工作臺P－545的單向重復(fù)性優(yōu)于雙向。因此，采用如圖4所示的單向梳狀掃描路徑，并以100μm／s的速度運(yùn)動的，在這個速度下運(yùn)動，工作臺狀態(tài)比較穩(wěn)定。

采集卡需要工作在有限連續(xù)采集模式下，具體方法：給每一行分配一個指定大小的緩存區(qū)，當(dāng)工作臺運(yùn)動到每一行的目標(biāo)位置時，恰好使采集到的數(shù)據(jù)填滿緩存區(qū)，讀取后清空緩存區(qū)；工作臺沿縱向只移動步距，不采集數(shù)據(jù)。每行采集均重復(fù)此過程，采集卡在該模式下工作，沒有任何數(shù)據(jù)被覆蓋掉。除此之外，為了實現(xiàn)工作臺運(yùn)動與數(shù)據(jù)采集同步，還需將工作臺與采集卡參數(shù)匹配設(shè)置，表1列舉了一些工作臺與采集卡設(shè)置的參數(shù)，根據(jù)不同的需求，選擇合適的掃描范圍。其中，掃描范圍、掃描速度與像素數(shù)目決定了成像時間，掃描范圍與像素數(shù)目決定了取樣間隔，繼而影響了分辨率，表1給出的參數(shù)滿足實現(xiàn)高分辨率成像的要求。根據(jù)實際情況對分辨率的不同要求，調(diào)整表中的參數(shù)，在相同掃描范圍與像素數(shù)目下，采樣率越高，賦值范圍越小，去噪效果越好。

表1 同步參數(shù)設(shè)置Tab.1 Synchronous parameter setting

3.2 系統(tǒng)軟件設(shè)計

圖5為數(shù)據(jù)同步采集模塊的軟件設(shè)計流程圖。首先，設(shè)置工作臺掃描速度與掃描范圍；然后，設(shè)置采樣率，使采樣率、掃描速度和掃描范圍完全匹配，即保證工作臺運(yùn)動到目標(biāo)位置時，采集卡緩存區(qū)剛好被填滿，其中，循環(huán)次數(shù)由像素數(shù)決定。

操作控制界面如圖6所示，主要包括光源控制模塊、采集參數(shù)設(shè)置、工作臺控制器參數(shù)設(shè)置、實時顯示模塊。

圖5 數(shù)據(jù)同步采集模塊流程圖Fig.5 Flow chart of synchronous data acquisition

圖6 系統(tǒng)控制界面Fig.6 Software interface window of the system

4 實驗結(jié)果

本文所研究的顯微鏡實驗裝置如圖7所示，鑒于穩(wěn)定性的要求，加工了三維支架，保證了絕對水平和垂直。為了方便尋找細(xì)胞，將分光鏡分離的另一束光成像在CCD上，并且在工作臺下方安裝了粗調(diào)X，Y兩個方向的底座。

實驗中所采用的樣品是老鼠腦細(xì)胞，細(xì)胞的平均尺寸約為10μm。將表1中的參數(shù)輸入軟件中，完成圖像掃描，可獲得如圖8（b）所示的共焦掃描圖像，并與蔡司寬場顯微鏡對該細(xì)胞拍攝的圖像進(jìn)行對比，如圖8（a）所示，可以看出寬敞顯微鏡只能看到細(xì)胞的輪廓，而我們研制的共焦顯微鏡可分辨的細(xì)節(jié)在400nm左右 。

圖7 實驗裝置Fig.7 Experiment device

圖8 對比結(jié)果Fig.8 Comparision of results

5 結(jié) 論

本文研制的基于工作臺連續(xù)運(yùn)動的LCSM系統(tǒng)，完成了系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集的任務(wù)，利用有限連續(xù)采集模式，解決了機(jī)械控制與數(shù)據(jù)采集難以同步的問題，并在此基礎(chǔ)上完成了軟件系統(tǒng)的開發(fā)工作。與傳統(tǒng)的多幀取平均掃描方式相比，大大地提高了成像速度。本文所述的實驗結(jié)果是在納米位移臺單向掃描方式下獲得的，若納米位移臺雙向重復(fù)性好，能夠?qū)崿F(xiàn)雙向掃描，還可以進(jìn)一步提高成像速度。

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