黃粉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)模擬與序列分析

余 磊，韓雅莉

（1．武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢430205；2．廣東工業(yè)大學(xué)，廣東 廣州510006）

黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）俗稱(chēng)黃粉甲、面包蟲(chóng)，原產(chǎn)于南美洲，屬于倉(cāng)庫(kù)和貯藏害蟲(chóng)。因其營(yíng)養(yǎng)成分高，營(yíng)養(yǎng)含量居各類(lèi)活體動(dòng)物蛋白飼料之首，被譽(yù)為“蛋白質(zhì)飼料寶庫(kù)”。作者所在課題組從黃粉蟲(chóng)體內(nèi)分離純化得到黃粉蟲(chóng)纖溶酶［1，2］，對(duì)其基因DNA序列進(jìn)行了分析，克隆得到其中一種黃粉蟲(chóng)纖溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：JN662461），并將其表達(dá)［3］。在此，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶序列進(jìn)行多方位分析、確定活性中心的位置，建立了可靠的黃粉蟲(chóng)纖溶酶三維結(jié)構(gòu)模型，并揭示了黃粉蟲(chóng)纖溶酶的纖溶機(jī)理。

1 方法

要想了解蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，需要將蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶，用X－射線衍射分析蛋白質(zhì)的單晶才能完成。但是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件苛刻，而且不是所有蛋白質(zhì)都能形成單晶，因此實(shí)施起來(lái)受到限制。利用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)，人們可以對(duì)已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)還能對(duì)蛋白質(zhì)序列中的每一個(gè)氨基酸逐個(gè)分析。因此，比較蛋白質(zhì)模建，又稱(chēng)同源模建，逐漸成為目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法［4－6］。

將黃粉蟲(chóng)纖溶酶的序列提交到NCBI的自動(dòng)比較蛋白質(zhì)模建服務(wù)器Blast上，通過(guò)程序，自動(dòng)確定黃粉蟲(chóng)纖溶酶序列活性中心與底物結(jié)合部位；將黃粉蟲(chóng)纖溶酶蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入Biosun軟件，軟件自動(dòng)選取蛋白質(zhì)Tryp＿SPc［cd00190］為模板，模擬得到黃粉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)，并利用Blast比較模板蛋白與黃粉蟲(chóng)纖溶酶的同源性；利用Goldkey軟件，對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶全序列等電點(diǎn)、親水性、柔性進(jìn)行分析，基于無(wú)模型比對(duì)時(shí)活性中心氨基酸殘基的性質(zhì)，進(jìn)一步闡明黃粉蟲(chóng)纖溶酶的纖溶機(jī)理。

2 結(jié)果與討論

2．1 黃粉蟲(chóng)纖溶酶序列分析（圖1）

圖1 黃粉蟲(chóng)纖溶酶序列分析Fig．1 The sequence analysis of fibrinolysin fromTenebrio molitor

由圖1可知，黃粉蟲(chóng)纖溶酶序列的活性中心（Active sites）為 H72、D117、S212，底物結(jié)合部位（Substrate binding sites）為：D207、S228、G230。

2．2 三維結(jié)構(gòu)模擬與評(píng)估

黃粉蟲(chóng)纖溶酶的模擬三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2，模板蛋白和黃粉蟲(chóng)纖溶酶的同源性比較見(jiàn)表1。

圖2 黃粉蟲(chóng)纖溶酶模擬三維結(jié)構(gòu)Fig．2 The analogous 3D－structure of fibrinolysin from Tenebrio moliter

圖2中，a、b、c 3個(gè)球狀模型，分別對(duì)應(yīng)黃粉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心S212、H72、D117三個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈：羥基、咪唑基、羧基，與胰蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)一致［7，8］。d、e、f三處肽鍵鏈狀模型，分別對(duì)應(yīng)黃粉蟲(chóng)纖溶酶的底物結(jié)合部位D207、S228、G230。由三維結(jié)構(gòu)可以看出底物結(jié)合部位和活性中心均沒(méi)有α－螺旋和β－折疊（α－螺旋為柱狀區(qū)，β－折疊為板狀區(qū)），該區(qū)域容易發(fā)生形變，在催化過(guò)程中與底物結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生誘導(dǎo)契合，符合酶催化理論；酶活中心處于蛋白質(zhì)中心凹穴處，與通常對(duì)纖溶酶活性中心的認(rèn)識(shí)一致［9，10］。本課題組前期研究中曾發(fā)現(xiàn)黃粉蟲(chóng)纖溶酶受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的抑制，推測(cè)其為絲氨酸蛋白酶［2，3］，此推測(cè)與生物信息學(xué)方法找到的活性中心S212相吻合。

黃粉蟲(chóng)纖溶酶的序列為：MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPA－LRSYIQQTAGI。

模板蛋白序列為：IVGGSEAKIGSFPWQVSLQYTGGRHFCGGSLISPRWVLTAAHCVYSSAPSNYTVRLGSHDLSSNEGGGQVIKVKKVIVHPNYNPSTYDNDIALLKLKRPVTLSDNVRPICLPSSGYNLPAGTTCTVSGWGRTSEGGPLPDVLQEVNVPIVSNAECKRAYSYGGTITDNMLCAGGLEGGKDACQGDSGGPLVCNDNGRGVLVGIVSWGSGCARPNYPGVYTRVSSYLDWIQKT。

表1 模板蛋白和目的蛋白同源性比較Tab．1 The homology comparison between the template protein and the target protein

由表1可知，Blast評(píng)分為186，說(shuō)明模板蛋白和目的蛋白的同源性比較高；序列覆蓋率達(dá)到了94%；隨機(jī)匹配的可能性非常小，僅為2E－62，說(shuō)明兩個(gè)蛋白出現(xiàn)相同的序列并非偶然；最大序列的相似度達(dá)到51%。表明，以此模板蛋白進(jìn)行同源模建，所得結(jié)構(gòu)是比較可信的。

2．3 Goldkey軟件的序列分析

在黃粉蟲(chóng)纖溶酶三維結(jié)構(gòu)分析中，采用的是同源模建的方法。預(yù)測(cè)過(guò)程中，其它蛋白質(zhì)與目標(biāo)預(yù)測(cè)物的差異，會(huì)導(dǎo)致一定程度的偏差。采用Goldkey軟件對(duì)序列的每個(gè)殘基逐個(gè)計(jì)算其特性，雖然無(wú)法得到三維結(jié)構(gòu)，但是其數(shù)據(jù)可靠性更好，更能反映目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性。用Goldkey軟件分別對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列進(jìn)行等電點(diǎn)模擬、親水性模擬、柔性模擬，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3a可知，黃粉蟲(chóng)纖溶酶的等電點(diǎn)為9．16，在人體內(nèi)正常生理環(huán)境下，該酶帶正電。而纖維蛋白通常帶負(fù)電荷，所以黃粉蟲(chóng)纖溶酶很容易靠近纖維蛋白，并與之結(jié)合。因此，黃粉蟲(chóng)纖溶酶對(duì)血栓有一定的靶向作用。

對(duì)于水溶性球形蛋白，親水值較低的氨基酸，趨向于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，親水值較高的氨基酸，趨向于蛋白質(zhì)的外部。由圖3b可知，H72、S212、D207親水值較低，而且H72和D207是局部親水值最低點(diǎn)，應(yīng)該在球蛋白內(nèi)部；S228、G230親水值較高，應(yīng)該在球蛋白外部，與三級(jí)結(jié)構(gòu)相符。

圖3 等電點(diǎn)模擬（a）、親水性模擬（b）和柔性模擬（c）Fig．3 The isoelectric point analogue（a），hydrophilicity analogue（b）and flexibility analogue（c）

由圖3c可知，活性部位H72、D117、S212的柔性值比較小，幾乎是整條鏈上最小的區(qū)域，說(shuō)明組成酶活性中心的3個(gè)氨基酸殘基的空間位置相對(duì)固定，因而活性中心的相對(duì)結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，在自然狀態(tài)下不會(huì)隨意發(fā)生變形，底物結(jié)合部位中S228、G230的柔性值比較小，說(shuō)明這兩個(gè)殘基的空間相對(duì)位置比較固定，D207的柔性值比較大，這符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)契合理論。在結(jié)合底物時(shí)，酶的結(jié)合部位和底物的結(jié)構(gòu)都發(fā)生了一定的形變（柔性才能形變），兩者在空間結(jié)構(gòu)上剛好互補(bǔ)，從而能很好地契合。全鏈柔性分析表明，黃粉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心和底物結(jié)合部位符合酶催化機(jī)理，從另一側(cè)面證明了活性中心預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

2．4 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用于精氨酸－賴(lài)氨酸肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^(guò)程［11，12］。

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法，模擬黃粉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)，并對(duì)其全序列進(jìn)行了分析。確定黃粉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心為 H72、D117、S212，底物結(jié)合部位為D207、S228、G230。黃粉蟲(chóng)纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測(cè)其催化纖維蛋白水解的機(jī)理是作用于精氨酸－賴(lài)氨酸肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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