甲狀旁腺素對大鼠正畸牙根吸收后修復(fù)期破骨細胞的影響＊

王生瑜，袁小平

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，蘭州 730020；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院正畸科／瀘州醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)和再生實驗室，四川瀘州 646000）

研究認為正畸炎性牙根吸收可以達3%～100%，但其可以部分自行修復(fù)［1］。牙根修復(fù)是骨吸收與重建的平衡過程，機制相對復(fù)雜：牙骨質(zhì)吸收及重新沉積，牙周組織的修復(fù)均參與其中［2］。甲狀旁腺素（PTH）是重要的骨代謝調(diào)節(jié)劑，研究證明間斷應(yīng)用少量PTH（1－34）利于骨組織的修復(fù)［3］，但它能否對牙根修復(fù)期持續(xù)進行的牙根吸收產(chǎn)生影響鮮有報道。因此本實驗以正畸誘導(dǎo)牙根吸收后的大鼠為研究對象，不同時間段皮下間斷注射少量PTH（1－34）后，免疫組織化學(xué)測定牙根修復(fù)期壓力側(cè)牙周組織中核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達變化規(guī)律，特殊染色計數(shù)牙根吸收面破骨細胞的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用6～8周雄性，體質(zhì)量200～250g SD大鼠63只（屬清潔級I級合格動物，由重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司實驗動物中心提供）。

1.2 方法

1.2.1 實驗大鼠正畸牙根吸收模型的建立 隨機選取大鼠一側(cè)上頜第一磨牙為實驗牙。在大鼠上頜前牙與第一磨牙之間安裝一個0.012英寸的鎳鈦拉簧，加載0.6N的力，使上頜第一磨牙向近中移動10d，建立牙根吸收模型。實驗牙移動10d后拆除移動裝置，對大鼠重新稱體質(zhì)量，應(yīng)用隨機數(shù)字表按體質(zhì)量隨機分為空白對照組、陰性對照組、實驗組，每組21只。體質(zhì)量采用方差分析進行多個樣本均數(shù)比較，結(jié)果表明3組動物的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2.2 PTH（1－34）注射實驗 拆除裝置后做如下的實驗處理：空白對照組不注射任何藥品；陰性對照組自拆除裝置當(dāng)日起在皮下注射6mL／kg生理鹽水，以后隔日注射；實驗組拆除裝置自當(dāng)日起在皮下注射6mL／kg PTH（1－34）和生理鹽水，以后隔日注射［5］。3組均在07、10、14、17、21、25d分別處死3只取材。

1.2.3 標(biāo)本制備和染色 取實驗側(cè)上頜骨包括3個完整的磨牙及牙根、牙槽骨的組織。固定，脫鈣，石蠟包埋，沿牙體長軸，按施力方向的近遠作3～5mm厚的連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)檢測RANKL的表達。本實驗采用山羊RANKL多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），SP免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）按說明書步驟進行免疫組織化學(xué)染色。陽性標(biāo)準(zhǔn)：胞漿為特異性棕黃色，陽性細胞著色水平明顯高于背景水平。

1.2.4 RANKL免疫組織化學(xué)表達測定 光鏡下在實驗牙顯示中央根及遠中根吸收面壓力側(cè)牙周組織15個高倍鏡視野（×200），經(jīng)攝像后，Image－pro－plus圖像分析系統(tǒng)的計算機中編輯處理，測得牙根吸收陷窩及臨近牙周組織RANKL表達陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

1.2.5 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色破骨細胞檢測 采用Nikon ECLIPES TE2000－S多功能全自動顯微鏡對大鼠TRAP染色切片進行觀察，并用Nikon DXM 1200C數(shù)碼相機在第一磨牙中央根與遠中根牙根吸收面隨機選取采集各時像點15個高倍鏡視野（×200），計數(shù)TRAP陽性染色的破骨細胞數(shù)，計算均數(shù)。以紅色顆粒代表TRAP陽性的信號，TRAP陽性染色胞核在3個或3個以上的且位于第一磨牙中央根與遠中根根中區(qū)及附近根尖區(qū)牙根吸收面的細胞計數(shù)為陽性破骨細胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；同組不同時間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)楞個木素－伊紅（HE）染色后光鏡下觀察結(jié)果 中斷加10d牙根吸收陷窩均未見修復(fù)性牙骨質(zhì)沉積。10d時牙根吸收陷窩邊緣開始出現(xiàn)一層紫染的修復(fù)性牙骨質(zhì)沉積線。見圖1。

圖1 10d牙根面牙骨質(zhì)修復(fù)情況光鏡檢查（HE×200）

2.2 RANKL免疫組織化學(xué)表達測定結(jié)果 實驗組相對于空白對照組、陰性對照組7、10dRANKL表達顯著增強，21d起表達顯著減弱。見圖2、3。比較3組0、7、10、14、17、21、25d牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中RANKL表達光密度值發(fā)現(xiàn)，在實驗組與空白對照組，實驗組與陰性對照組組間比較7、10、21、25d差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

圖2 實驗組RANKL表達7d（×200）

圖3 實驗組RANKL表達21d（×200）

表1 牙根壓力側(cè)RANKL表達平均光密度值（）

表1 牙根壓力側(cè)RANKL表達平均光密度值（）

a：P＜0.01，與空白對照組比較；b：P＜0.01，與陰性對照組組比較。

空白對照組 陰性對照組 實驗組0 0.1461±0.00010.1463±0.00030.1464±0.0003時間（d）7 0.1722±0.00030.1728±0.00040.2067±0.0004ab 10 0.2365±0.00030.2368±0.00020.2669±0.0004ab 14 0.1943±0.00030.1943±0.00020.1943±0.000217 0.2328±0.00010.2322±0.00040.2324±0.000321 0.2119±0.00020.2120±0.00170.1871±0.0005ab 25 0.2020±0.00010.2030±0.00020.1786±0.0005ab

2.3 TRAP染色破骨細胞檢測結(jié)果 TRAP染色0d，壓力側(cè)根面及牙周組織中可見大量陽性染色破骨細胞定位于破牙或破骨細胞的胞漿內(nèi)，見圖4。0、7、10、14、17、21、25d牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中破骨細胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，各時間點空白對照組、陰性對照組、實驗組組間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖4 TRAP染色0d破骨細胞（×200）

表2 牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中破骨細胞數(shù)（）

表2 牙根面吸收陷窩及臨近牙周組織中破骨細胞數(shù)（）

時間（d） 空白對照組 陰性對照組 實驗組0 11.003±0.02511.040±0.03411.050±0.0207 5.310±0.017 5.340±0.051 5.350±0.04410 3.110±0.035 3.260±0.606 2.980±0.04614 1.350±0.030 1.370±0.036 1.360±0.05217 0.260±0.030 0.280±0.010 0.260±0.03621 0.230±0.010 0.240±0.065 0.250±0.02025 0.240±0.026 0.210±0.036 0.230±0.026

3 討 論

正畸過程中常見的牙根吸收是由牙齒移動引起的醫(yī)源性并發(fā)癥，怎樣減少牙根吸收是近年來正畸醫(yī)生比較關(guān)注的焦點。PTH是重要的鈣、磷調(diào)節(jié)因子，間歇給藥有促進骨形成作用［3］。據(jù)此，本實驗選擇皮下小劑量間斷注射給藥途徑，以觀察在大鼠牙根修復(fù)期是否通過成骨作用抑制修復(fù)期仍持續(xù)的牙根吸收。

本實驗選用0.5N的力持續(xù)移動實驗牙齒10d復(fù)制牙根吸收模型。結(jié)果在實驗的早期（即0～14d），3組均可見牙根面有破骨細胞出現(xiàn)且都呈現(xiàn)遞減趨勢，說明牙根吸收模型復(fù)制成功；去除加力裝置后牙根吸收均未停止，這與文獻［6－7］的研究結(jié)果相似，是因為正畸性壓力停止后，透明樣化組織區(qū)仍存在持續(xù)吸收，以達到根吸收范圍與透明樣化區(qū)的最大范圍一致，證明隨著中斷加力時間的延長，牙根吸收是逐漸向修復(fù)轉(zhuǎn)變的。RANKL是破骨細胞活性標(biāo)志物。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)全身間斷運用PTH后大鼠壓力側(cè)牙周組織中RANKL的表達相對于未注射PTH組的實驗大鼠牙周組織中變化顯著，呈現(xiàn)早期升高晚期降低，證明小劑量間斷應(yīng)用PTH（1－34）對牙周組織中RANKL表達產(chǎn)生了影響。早期升高是因為PTH發(fā)揮成骨作用需要破骨細胞的參與，刺激了破骨及破牙骨質(zhì)細胞的成熟和活性［8－9］；后期RANKL表達減弱是因為PTH發(fā)揮了成骨作用，這與Lossd?rfer等［10］觀點一致，其細胞實驗證明間斷應(yīng)用PTH可以抑制牙周組織中破骨細胞的分化；本實驗發(fā)現(xiàn)PTH對破骨細胞及破牙骨質(zhì)細胞數(shù)目變化沒能產(chǎn)生有效影響，分析原因可能是體外細胞實驗與體內(nèi)實驗有區(qū)別：牙周組織對外源性PTH（1－34）有清除作用［11］，體內(nèi)實驗時皮下注射進入體內(nèi)的PTH（1－34）量很少導(dǎo)致早期PTH（1－34）在牙周組織中的劑量有限，作用較微弱，不能對吸收陷窩中破牙骨質(zhì)細胞及臨近牙周組織中破骨細胞數(shù)量產(chǎn)生有效影響，因此對于修復(fù)早期仍持續(xù)存在的牙根吸收未產(chǎn)生明顯抑制作用；可是隨著時間的延長晚期PTH（1－34）的量在牙周組織中大量積聚對RANKL的表達產(chǎn)生了抑制作用，這可能利于打破骨平衡使得其向成骨轉(zhuǎn)化，有待后續(xù)研究。

本實驗研究結(jié)果說明通過皮下間斷少量運用PTH對修復(fù)早期仍持續(xù)的牙根吸收不能產(chǎn)生抑制作用。

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