星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化α-細(xì)辛腦脂質(zhì)體噴鼻劑的制備工藝Δ

陳穎，黃海潮，朱慶玲，祝紅，伍善廣（.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州50520；2.柳州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣西柳州 545006）

α-細(xì)辛腦（α-Asarone，ARE）是天南星科植物石菖蒲的主要活性成分之一，又名α-細(xì)辛醚、細(xì)辛醚和細(xì)辛腦（Asarone）[1]?？捎糜谥箍取⒒?、平喘，對肺炎、慢性氣管炎、支氣管哮喘均有較好的療效[2-3]。細(xì)辛腦為脂溶性極強(qiáng)的化合物，制成生物利用度高的口服固體制劑有一定困難。文獻(xiàn)報道細(xì)辛腦膠囊劑絕對生物利用度僅為2.7%，片劑絕對生物利用度也很低，僅9.7%[4]。效應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）是統(tǒng)計與設(shè)計試驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的方法[5-6]，與正交設(shè)計和均勻設(shè)計相比，效應(yīng)面法可用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果[7]。

筆者采用星點(diǎn)設(shè)計（Central composite design，CCD）-效應(yīng)面法優(yōu)化ARE脂質(zhì)體噴鼻劑的制備工藝，用乙醇注入法[8]將細(xì)辛腦包入脂質(zhì)體，制備成噴鼻劑，達(dá)到肺部直接給藥，對于提高細(xì)辛腦治療肺部疾病的效果與細(xì)辛腦的生物利用度有重要意義。

1 材料

DF-101S集熱式磁力攪拌器（金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）；FJ-200高速分散勻質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠制造）；島津高效液相色譜儀，包括LC-10AT泵、SPD-10A紫外檢測器（日本島津公司）；Nano-ZS 90粒徑測定儀（英國馬爾文公司）；JEM.100CX型透射電鏡（日本日立公司）。

ARE對照品及原料藥（廣西億康藥業(yè)股份有限公司，批號：080626，純度：98.6%）；卵磷脂（德國利保益有限公司，批號：1032917）；膽固醇（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號：100918）；維生素E（武漢銀河化工有限公司，批號：20091015）；Sephadex-G50（上海源聚生物科技有限公司，進(jìn)口分裝）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

精密稱取卵磷脂、膽固醇、維生素E，置于小燒杯中，加入適量的恒溫?zé)o水乙醇，攪拌使溶解，再加入ARE，攪拌混勻。慢慢勻速注入水浴恒溫的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，攪拌30 min，水浴保溫50 min，放置1 h使其充分水合，用高速分散勻質(zhì)機(jī)以5 000 r/min勻質(zhì)3次，每次10 min，分裝至噴霧器中，冷處保存，即得ARE脂質(zhì)體噴鼻劑。單因素試驗(yàn)以制劑在顯微鏡下觀察的形態(tài)、放置是否分層以及包封率為主要指標(biāo)進(jìn)行考察。

2.1.1 磷脂含量的影響。磷脂是脂質(zhì)體成膜的主要成分，本試驗(yàn)考察了1%～8%的磷脂含量。結(jié)果當(dāng)磷脂含量達(dá)6%時，脂質(zhì)體就會出現(xiàn)不同程度的析出；而磷脂含量過低，則會不利于包封率的提高；當(dāng)磷脂含量在3%～5%時，穩(wěn)定性和包封率都較高；磷脂含量為4%時，包封率最高。磷脂含量對包封率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 磷脂含量對包封率的影響結(jié)果Fig1 Effects of phospholipid content on entrapment efficiency

2.1.2 膽固醇含量的影響。膽固醇是膜固化的重要成分，本試驗(yàn)以磷脂-膽固醇之比固定膽固醇的含量，考察了磷脂-膽固醇為1∶1～10∶1的比例。結(jié)果當(dāng)膽固醇含量過低，會影響脂質(zhì)體的成膜性；當(dāng)磷脂-膽固醇之比達(dá)10∶1時，脂質(zhì)體容易出現(xiàn)絮凝或沉淀現(xiàn)象；磷脂-膽固醇之比在4∶1～8∶1時，穩(wěn)定性和成膜性較佳。膽固醇含量對包封率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 膽固醇含量對包封率的影響結(jié)果Fig2 Effects of cholesterol content on entrapment efficiency

2.1.3 PBS pH值的影響。本試驗(yàn)考察了pH值為6.3、6.5、6.8、7.0、7.2的PBS。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值對脂質(zhì)體的包封率影響不大，但是對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性影響比較大，pH 6.8、7.0的PBS制備的脂質(zhì)體穩(wěn)定性較好。考慮到pH 6.8更接近鼻腔pH值[9]，故選擇PBS的pH值為6.8。

2.1.4 投藥量的影響。本試驗(yàn)以磷脂-藥物之比固定投藥量。結(jié)果，隨著ARE的投藥量的增加，包封率呈上升趨勢；但當(dāng)磷脂-ARE之比小于30∶1時，顯微鏡下觀察可見不同程度的晶體，且包封率呈降低趨勢。投藥量對包封率的影響結(jié)果見圖3。

2.1.5 維生素E用量的影響。維生素E有抗氧化的作用，有利于脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，但如果用量太大，反而會加速脂質(zhì)體的絮凝與析出。當(dāng)維生素E含量為0.1%（W/W）時，顯微鏡觀察無油滴析出，且脂質(zhì)體穩(wěn)定性最好。

2.1.6 水浴溫度的影響。制備溫度對制劑影響較小，考慮到高溫可加速磷脂和藥物的氧化，通過試驗(yàn)且參考有關(guān)文獻(xiàn)[10]，將制備溫度控制在55℃左右。

2.2 中心組合優(yōu)化設(shè)計

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取磷脂含量（X1），磷脂-膽固醇之比（X2）和磷脂-藥物之比（X3）3個因素，采用3因素5水平效應(yīng)面分析方法，星點(diǎn)設(shè)計因素水平見表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計因素水平Tab1 Levels and factors of central composite design

2.3 包封率的測定[11]

2.3.1 色譜條件。采用高效液相色譜法測定ARE含量。色譜柱：Agilent Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（65∶35，V/V）；流速：1.0 ml/min；紫外檢測波長：313 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取ARE對照品10 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇-水（65∶35，V/V）溶解并稀釋至刻度，搖勻，得ARE對照品貯備液。精密量取該貯備液0.4、1.6、3.2、4.0、5.0、6.0 ml分別置10 ml量瓶中，加甲醇-水（65∶35，V/V）稀釋至刻度，搖勻。分別取上述溶液各20 μl，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行回歸分析，得方程A＝40 040c+50 817（r＝0.999 5，n＝5）。結(jié)果表明，ARE在8～120 μg/ml檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度和重復(fù)性試驗(yàn)。取“2.3.2”項下64 μg/ml的溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算得出RSD＝0.32%（n＝6），表明進(jìn)樣精密度良好。取同一批ARE脂質(zhì)體5份，按“2.3.5”項下方法，測定ARE的含量，結(jié)果RSD＝1.11%（n＝5），表明該含量測定方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，室溫放置0、1、2、4、6、8 h后分別測定ARE的含量，結(jié)果RSD＝0.92%（n＝6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)。將一定量的ARE對照品貯備液與空白脂質(zhì)體按一定比例混合成50%、60%、70%的ARE濃度，加入一定量的甲醇破乳，用甲醇-水（65∶35，V/V）稀釋的樣品各3份，按“2.3.1”條件進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果平均回收率為98.21%，RSD＝1.16%（n＝9）。

2.3.6 凝膠柱分離測定脂質(zhì)體中游離藥物。吸取1 ml的脂質(zhì)體，上樣于已用pH 6.8 PBS平衡好的Sephadex-G50柱（1.6 cm×50 cm）上，用pH 6.8 PBS洗脫，流速為1.0 ml/min。分次收集洗脫液，每次5.0 ml，通過觀察流動吸光度的變化監(jiān)測脂質(zhì)體與藥物的分離情況。收集游離藥物，按“2.3.1”條件測定藥物質(zhì)量濃度。

2.3.7 柱回收率考察。吸取“2.3.5”的高、中、低濃度的ARE對照品與空白脂質(zhì)體的混合液各1 ml，按“2.3.6”項下的條件進(jìn)行試驗(yàn)，測得柱加樣回收率平均值為98.5%。配制高、中、低濃度的ARE對照品溶液，吸取1 ml，同法測定。結(jié)果ARE柱回收率平均值為99.2%。

2.3.8 包封率的計算。精密量取ARE脂質(zhì)體0.2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入一定量的甲醇破乳，搖勻，待溶液完全澄清透明后用甲醇-水（65∶35，V/V）稀釋至刻度，搖勻，按“2.3.1”條件進(jìn)行測定，求出脂質(zhì)體中ARE的含量。精密量取ARE脂質(zhì)體混懸液1 ml，按“2.3.6”項下的條件進(jìn)行試驗(yàn)，測定游離藥物的量。按下式計算包封率[12]：

包封率（%）＝（W總－W游）/W總×100%（W總：總藥物量，W游：未包入脂質(zhì)體的游離藥物量）

2.4 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方[13-14]

以包封率（Y）為評價指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸模型各項方差分析表3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計及結(jié)果Tab2 Central composite design and its results

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert?8.0軟件，進(jìn)行二次多項式逐步回歸擬合，得到模型為：Y＝65.48+4.02X1+6.63X2+2.19X3－0.051X1X2+1.27X1X3－1.01X2X3－5.68X12－3.95X22－

表3 回歸模型各項方差分析Tab3 Analysis of variance for fitted regression model

從表3方差分析結(jié)果可見，試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂懈叨鹊娘@著性（P＜0.01）。X1、X2對包封率影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X2、X1X3、X2X3的P值均大于0.05，說明這3個因素之間的交互作用不大。R2＝0.907 4，說明模型能夠很好地反映響應(yīng)值的變化，擬合度好?？梢杂么四Ｐ蛠矸治龊皖A(yù)測ARE脂質(zhì)體的工藝結(jié)果。

各因素的交互結(jié)果見圖4。

圖4 不同因素組合對包封率影響的曲面圖A.Y＝f（X1，X2）的效應(yīng)面圖；B.Y＝f（X1，X3）的效應(yīng)面圖；C.Y＝f（X2，X3）的效應(yīng)面圖Fig4 Response surfaces of the effects of different factors on entrapment efficiencyA.response surface of Y to X1and X2；B.response surface of Y to X1and X3；C.response surface of Y to X2and X3

由圖4可見，磷脂-膽固醇之比對脂質(zhì)體包封率影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，最佳值為7.59；磷脂-藥物之比影響較小，曲線較為平滑，最佳值為43.32。

2.5 最優(yōu)處方工藝驗(yàn)證

通過Design-Expert?8.0軟件，結(jié)合表3方差分析的結(jié)果，在得到最大包封率的同時綜合考慮工業(yè)可行性和投入產(chǎn)出比，選取ARE脂質(zhì)體最佳制備工藝：磷脂含量4.5%、磷脂-膽固醇之比7.5、磷脂-藥物之比45。按照選取的最佳工藝條件重復(fù)3次試驗(yàn)，將預(yù)測值與實(shí)測值進(jìn)行比較并計算偏差[偏差＝（預(yù)測值－實(shí)測值）/預(yù)測值×100%]，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 4Results of validation test（n＝3）

由表4可見，預(yù)測值與實(shí)測值的偏差為1.73%，說明采用效應(yīng)面分析法得到的工藝準(zhǔn)確可靠。

2.6 脂質(zhì)體形態(tài)觀察

對最優(yōu)工藝制備的脂質(zhì)體進(jìn)行粒徑、Zeta電位測定，電鏡掃描表面形態(tài)。經(jīng)激光粒度分析儀測定，ARE脂質(zhì)體粒徑主要集中在200 nm波長處，ARE脂質(zhì)體的的粒徑分布見圖5；Zeta電位為－24.9 mV；用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片，ARE脂質(zhì)體的掃描電鏡圖見圖6。

圖5 ARE脂質(zhì)體的的粒徑分布Fig5 Distribution of particle size ofARE liposome

圖6 ARE脂質(zhì)體的掃描電鏡圖（×27 000）Fig6Scanning electron micrograph ofAREliposome（×27000）

由圖6可見，不同粒徑的脂質(zhì)體形態(tài)完整，雙分子膜結(jié)構(gòu)清晰，均屬于單室脂質(zhì)體，脂質(zhì)體內(nèi)部包裹有細(xì)辛腦使脂質(zhì)體在透射電鏡下顏色變亮，脂質(zhì)體的相互分界明顯。

3 討論

脂質(zhì)體肺部給藥具有吸收迅速、刺激性小、耐受性好、安全性高，可實(shí)現(xiàn)持續(xù)緩慢釋藥、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)。脂溶性藥物在水中的溶解性差，肺部溶解量有限；制成脂質(zhì)體后，可改善溶解性，從而提高有效藥物濃度。乙醇注入法制備脂質(zhì)體是最簡單的制備方法之一，該方法操作簡便、設(shè)備簡單、重現(xiàn)性好，適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要。將ARE制成脂質(zhì)體，經(jīng)噴霧器霧化實(shí)現(xiàn)鼻腔給藥，吸入肺部，在治療肺局部疾?。ㄈ缦?、肺氣腫及囊性纖維化等）時，使藥物直接濃集于病灶區(qū)，起效快、劑量低、作用時間長、進(jìn)入體循環(huán)的藥量小、不良反應(yīng)少。

星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法是比較適宜進(jìn)行非線性擬合的優(yōu)化法。結(jié)果表明該組數(shù)據(jù)代入最佳模型方程獲得的理論預(yù)測值與實(shí)測值比較吻合，證實(shí)所建立的數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測性。此外，通過最優(yōu)處方工藝驗(yàn)證試驗(yàn)證明，所得處方工藝包封率高、重現(xiàn)性較好，達(dá)到了優(yōu)選處方工藝的目標(biāo)。

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