95%乙醇提取白胡椒中胡椒堿的工藝研究

石寶俊，高君澤，黃曉德，趙伯濤*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇南京 210046)

胡椒為胡椒科植物胡椒(Piper nigrum L.)的果實。當果穗基部的果實開始變紅時，剪下果穗，曬干或烘干后，即成黑褐色，取下果實，通稱黑胡椒。如全部果實均已變紅時采收，用水浸漬數(shù)天，擦去外果皮，曬干，則表面里灰白色，通稱白胡椒。

胡椒堿(C17H19NO3)為白胡椒的活性成分，具有抗腫瘤［1］、抗氧化［2］、抗消化系統(tǒng)潰瘍［3］、抗抑郁［4］、抗免疫調(diào)節(jié)等作用［5］。劉文等［6］同時用酸水和75%乙醇進行提取胡椒堿，比較后發(fā)現(xiàn)pH值為3.5的酸水提取只比乙醇提取略低，認為乙醇的提取、回收成本較高，酸水提取更好。侯文潔等［7］則選擇用甲醇提取胡椒堿，他們認為乙醇價格高，大規(guī)模生產(chǎn)成本較高，用水做提取價格便宜，但提取得到的水溶性成份多，后處理成本較高。選擇甲醇為提取劑，所獲得的提取率高，而且后期處理工藝相對簡單。但是其有毒，工業(yè)生產(chǎn)不安全。用乙醇提取白胡椒時，隨乙醇中含水量的增加，提取率增加，同時后續(xù)的操作如過濾和濃縮的難度也增加。故在提盡胡椒堿的前提下，采用無水乙醇和95% 乙醇使提取過程簡化，提取效果較好;而比較二者，95%乙醇更適合［8］。另外，95%乙醇提取的黑胡椒油樹脂得率最低［9］，后處理簡單。本實驗采用95%乙醇提取胡椒堿，用95%乙醇提取，蒸餾回收后的乙醇還是95%，可以循環(huán)使用。

1 材料

1.1 儀器

Agilent高效液相儀，紫外檢測器;Agilent ZORBAX－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，SF－400 電子天平(好又多電器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)，DW調(diào)溫電熱器(上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)學(xué)器械廠)。

1.2 藥物與試劑

白胡椒(海南省國營東昌農(nóng)場)，乙醇(體積分數(shù)95%，食品級)，甲醇(色譜純)，重蒸水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相:甲醇－水(70∶30);檢測波長為343 nm［10］;25℃;進樣量 20 μL，流速 l mL/min。胡椒堿在此條件下保留時間約為5.8 min。

2.2 標準曲線的繪制

精密稱取胡椒堿對照品25.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解至刻度，精密移取此溶液3，4，5，6，7，8 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，定容。按2.1項下色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程:y=149.30x－388.96，R2=0.9989，結(jié)果表明胡椒堿濃度在 60.48～161.28 μg/mL范圍內(nèi)，胡椒堿峰面積與進樣量有良好的線性關(guān)系。

圖1 胡椒堿標準曲線

2.3 胡椒堿的純度測定

取各條件制得的胡椒堿結(jié)晶2.5 mg置25 mL棕色容量瓶中，加95%乙醇定容成100 μg/mL的溶液。按2.1項下色譜條件精密吸取20 μL溶液進樣，所得峰面積帶入對照品標準曲線方程內(nèi)計算得出其實際濃度，然后計算其純度。

2.4 乙醇量及提取時間對提取率的影響

設(shè)計乙醇的用量為三個水平:10∶1，8∶1;8∶1，6∶1;6∶1，4∶1?；亓鲿r間也為三個水平即 1.5 h，1 h，0.5 h.

分別取100 g已粉碎白胡椒，置于燒瓶中，按下圖實驗設(shè)計所需加入95%乙醇并加熱回流提取規(guī)定時間，所得結(jié)果如下:

表1 實驗結(jié)果對照

從圖中可以看出，95%乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比分別為 8∶1，6∶1時，提取 1 h 和 1.5 h 明顯優(yōu)于0.5 h，提取1.5 h 和1 h 相差僅 4.3%，為了節(jié)約成本，故提取1 h更為合適;當提取時間為1 h時，乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為 10∶1，8∶1和 8∶1，6∶1的明顯優(yōu)于6∶1，4∶1，但用10∶1，8∶1的量僅比用8∶1，6∶1時多出 3.4%，乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為 8∶1，6∶1時更好。所以以乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為8∶1，6∶1，分別提取1 h最好，既能盡可能多得提取出胡椒堿，又節(jié)約生產(chǎn)成本。

2.5 重結(jié)晶時溫度的影響

表2 40℃，60℃，80℃下重結(jié)晶對胡椒堿結(jié)晶量的影響

取100 g胡椒，粉碎，分別加入1000 mL，800 mL乙醇提取兩次，每次1 h，制得的胡椒堿粗品在40℃，60℃，80℃下溶解，重結(jié)晶2次。從表2中可以看出，40℃下所得結(jié)晶很少，80℃時最多。但是考慮到80℃已經(jīng)超過乙醇的沸點，在此溫度下溶解胡椒堿粗品時，乙醇會很快蒸發(fā)，無法準確把握需要乙醇量;且結(jié)晶時發(fā)現(xiàn)，母液干涸，成果凍狀，不好分離出結(jié)晶，所得結(jié)晶純度較低。所以應(yīng)改考慮60℃和70℃情況下胡椒堿的結(jié)晶情況。

表3是胡椒堿在60℃，70℃下重結(jié)晶的比較。其中編號1～5提取胡椒堿時所用95%乙醇與胡椒堿的體積質(zhì)量比為10∶1，8∶1;除編號4以外均為重結(jié)晶2次。經(jīng)過HPLC測定編號4的樣品后發(fā)現(xiàn)，在60℃下重結(jié)晶一次純度便可達到90%以上。故在編號6～11的樣品均只結(jié)晶了1次，測定后發(fā)現(xiàn)純度均能超過90%。

由于在中期實驗中發(fā)現(xiàn)，提取液中的胡椒堿用10∶1，8∶1的量乙醇僅比用 8∶1，6∶1的量時多出3.4%，用乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為 8∶1，6∶1更好，所以編號6～11的樣品選用體積質(zhì)量比為8∶1，6∶1的比例。

表3 60℃和70℃下胡椒堿重結(jié)晶的比較

從表3中比較60℃和70℃重結(jié)晶后胡椒堿得率后可以發(fā)現(xiàn)，60℃和70℃相差不大。而60℃下的結(jié)晶純度比70℃下的稍高。70℃下胡椒堿的溶解率較高，相對60℃下結(jié)晶時加入的乙醇量難控制些，結(jié)晶顏色也比60℃下的深。故最終選定60℃為最佳重結(jié)晶溫度。

3 結(jié)論

本論文以白胡椒為實驗材料，使用體積分數(shù)為95%的乙醇進行提取胡椒堿，對乙醇法提取胡椒堿的工藝進行了研究。實驗采用高效液相色譜法對提取物的純度和提取率進行測定，以尋找最佳工藝流程的方法。通過實驗可以得出:用95%的乙醇提取胡椒堿，便于回收再利用，乙醇回收達80%以上。用乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為8∶1，6∶1回流提取1 h后，在60℃下重結(jié)晶胡椒堿粗品，所能得到的純度90%以上。本實驗所選用的工藝，產(chǎn)品經(jīng)精制后得到純度高，工藝簡單，適于大規(guī)模生產(chǎn)的特點，對大規(guī)模生產(chǎn)有借鑒意義。

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