4-硫-5-碘尿苷的合成及其與人血清白蛋白間的相互作用

王 健，鄭學(xué)仿，曹洪玉，張曉輝*

(1.大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連 116622; 2.遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116622)

1 引 言

1965年，Lipsett首先從大腸桿菌分離出4－thiouridylic acid，含硫及硫代類似物的DNA組成部分[如硫堿基(Thio－base) 和硫代核苷(thio－nuceloside)][1]。硫代DNA及硫代類似物擁有獨(dú)特的性質(zhì)，尤其是含硫堿基對(duì)紫外線的高靈敏度[2－7]。堿基(A，G，C，T)是DNA最主要的發(fā)色基團(tuán)，其吸收光譜分布在紫外短波區(qū)(260～270 nm)，而含硫類似物則在紫外長(zhǎng)波區(qū)(UVA)有吸收。徐耀忠等發(fā)現(xiàn)4－硫胸苷與UVA光作用能選擇地破壞DNA，高選擇性的殺死癌細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞僅有很小的附帶損害[8－11]，為癌癥和其它疾病治療提供一種新型的光化學(xué)療法[12－15]。人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的載體蛋白，它能結(jié)合、運(yùn)輸許多內(nèi)源和外源性化合物分子，是目前研究最多的一種蛋白質(zhì)[16]，常作為研究藥物與蛋白質(zhì)相互作用的模型蛋白[17]。因此，研究藥物分子與HSA之間的相互作用，有助于了解藥物在人體內(nèi)的運(yùn)輸、分布和代謝情況，對(duì)于闡明藥物的藥理作用和藥物代謝動(dòng)力學(xué)也具有非常重要的意義[18]。

本文設(shè)計(jì)合成了一種新的4－硫－5－碘尿苷化合物，發(fā)現(xiàn) 4－硫－5－碘尿苷的紫外光譜在 345 nm處有最大吸收，相對(duì)于5－碘尿苷對(duì)UVA光更敏感。利用計(jì)算與光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，進(jìn)一步研究了4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白(HSA)的相互作用機(jī)制，為硫代核苷對(duì)HSA性能的影響提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論根據(jù)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

儀器:JASCO－UV560型紫外－可見分光光度計(jì)(日本);JASCO－FP6500型熒光分光光度計(jì)(日本);JULABO－F12型制冷和加熱循環(huán)器(德國(guó)，±0.01℃);J－810圓二色分光光度計(jì)(日本 Jasco公司);PHB－4酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);FA1004電子天平(上海精科天平廠)。

試劑:HSA(去除脂肪酸和球蛋白，Sigma公司，純度為99%);三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海生化試劑廠);尿嘧啶核苷(Sigma公司，純度98%)。所用的其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子蒸餾水，無(wú)熒光雜質(zhì)。首先配制0.05 mol/L，pH 為7.40 的 Tris－HCl的緩沖溶液，然后用該 Tris－HCl溶液分別配制濃度為1.0 μmol/L的HSA溶液，以及濃度為1.0 mmol/L的4－硫－5－碘尿苷備用。

2.2 4－硫－5－碘尿苷的合成

4－硫－5－碘尿苷的合成路線如圖1所示。

圖1 4－硫－5－碘尿嘧啶核苷的合成路線Fig.1 The synthesis route of 4－thio－5－iodouridine

2.2.1 5－碘尿嘧啶核苷的合成(2)

將化合物尿苷(0.98 g，4.00 mmol)(1)溶于20 mL 0.3 mol/L的稀硝酸中，加入碘單質(zhì)(1.02 g，4.00 mmol)，110 ℃油浴加熱40 min(TLC 跟蹤監(jiān)測(cè))。反應(yīng)結(jié)束后熱過(guò)濾，濾液用石油醚萃取3次后，靜置于4℃冰箱中冷卻，過(guò)濾干燥得到白色針狀晶體(2)1.26 g，收率 75.32%。

m.p.:207～208 ℃ (文獻(xiàn)值 208 ～210℃)[19]。1H NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:3.54 ～3.73(m，2H，H－5'，5″)，3.89(d，J=4.0Hz，1H，H－4')，4.00(dd，J=4.0 Hz，8.0 Hz，1H，H－3')，4.05(dd，J=4.0 Hz，8.0 Hz，1H，H－2')，5.10，5.29，5.44(d，t，d，1H，1H，and 1H，OH's)，5.74(d，J=4.0 Hz，1H，H－1')，8.50(s，1H，H－6)，11.71(brs，1H，N—H)。UV(in CH3CN):λmax=280 nm。

2.2.2 2'，3'，5'－O－三氧乙?；?－碘尿嘧啶核苷(3)的合成

將化合物5－碘尿苷(1.00 g，2.70 mmol)(2)溶于15 mL無(wú)水吡啶中，冷卻至0℃，加入無(wú)水乙酸酐(3 mL，32 mmol)，在0℃下繼續(xù)攪拌5 h(TLC跟蹤監(jiān)測(cè))。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸出溶劑，用95%乙醇重結(jié)晶，得到白色晶體(3)1.23 g，收率 91.83%。

m.p.:177 ℃ (文獻(xiàn)值 177 ～ 178 ℃)[20]。1H NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:2.06，2.07，2.08(3s，3H，3H，3H，OAc's)，4.21～4.27(m，2H，H－5'，5″)，4.31 ～4.36(m，1H，H－4')，5.33 ～5.35(m，1H，H－3')，5.47(dd，J=8.0 Hz and J=8.0 Hz，1H，H－2')，5.88(d，J=4 Hz，1H，H－1')，8.18(s，1H，H－6)，11.83(brs，1H，NH)。UV(in CH3CN): λmax=226.5 nm。

2.2.3 2'，3'，5'－O－三氧乙?；?－硫－5－碘尿嘧啶核苷(4)的合成

將化合物 2'，3'，5'－O－三乙?；?－碘尿苷(1.00 g，2.01 mmol)(3)溶于30 mL 無(wú)水二氧六環(huán)中，加入五硫化二磷固體(0.85 g，3.84 mmol)，回流加熱1.5 h(TLC跟蹤監(jiān)測(cè))，整個(gè)體系處于N2保護(hù)條件下。反應(yīng)結(jié)束后，減壓除去溶劑，粗產(chǎn)品通過(guò)硅膠層析分離，得到黃色油狀產(chǎn)物0.76 g(4)，收率 73.82%。

1H NMR(400 MHz，DMSO－d6) δ:2.07，2.07，2.09(3s，3H，3H，3H，OAc's)，4.23～4.31(m，2H，H－5'，5″)，4.33 ～ 4.36(m，1H，H－4')，5.37(dd，J=4 Hz，8 Hz，1H，H－3')，5.51(dd，J=4.0，4.0 Hz，1H，H－2')，5.86(d，J=4 Hz，1H，H－1')，8.28(s，1H，H－6)，13.16(brs，1H，NH)。

2.2.4 4－硫－5－碘尿嘧啶核苷(5)的合成

將 2'，3'，5'－O－三 乙 酰 基－4－硫－5－碘 尿 苷(0.51 g，1.00 mmol)(4)溶于甲醇的氨氣飽和溶液(60 mL，1.50 mmol)中，在室溫下密閉攪拌4.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸出溶劑，粗產(chǎn)品通過(guò)硅膠層析分離，得到黃色固體0.47 g(5)，收率71.14%。

m.p.:173 ～174 ℃。1H NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.00(s，1H，N—H)，8.68(s，1H，H－6)，5.68(d，1H，J=4 Hz，H－1')，5.40，5.30，5.10(d，t，d，1H，1H，and 1H，OH's)，4.06(dd，1H，J=4Hz，J=4 Hz，H－2')，3.88 ～ 3.90(m，1H，H－3')，3.72(dd，1H，J=4 Hz，J=4 Hz，H－5')，3.58(dd，1H，J=4 Hz，J=4 Hz，H－5″)。UV(in CH3CN):λmax=349 nm。IR λmax(film)/cm－1:1 701.6( ==amide C O)，1 590.2(C==S)。HR－MS for M++1 calcd m/z 386.935 1，calcd for C9H12IN2O5S found 386.943 3。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 紫外吸收光譜

移取2 mL 1.0 μmol/L的HSA于1 cm 的石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器逐次加入適量的4－硫－5－碘尿苷溶液(累計(jì)體積不超過(guò)50 μL)，每次加入溶液后靜置3 min，測(cè)定220～450 nm的紫外吸收光譜。

2.3.2 熒光光譜

288 K 時(shí)，移取 2.5 mL 1.0 μmol/L 的 HSA于1 cm的石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器逐次加入適量的濃度為1.0 mmol/L 的 4－硫－5－碘尿苷溶液進(jìn)行熒光滴定(累計(jì)體積不超過(guò)50 μL)，每次加入溶液后靜置3 min，以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定290～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)HSA的熒光光譜以及HSA在4－硫－5－碘尿苷作用下的熒光猝滅光譜。按同樣的方法測(cè)定298 K和308 K下相應(yīng)的熒光光譜。

2.3.3 圓二色光譜

298 K 時(shí)，移取 0.5 mL 1.0 μmol/L 的 HSA于1 mm的石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器依次加入適量的濃度為1.0 mmol/L 的 4－硫－5－碘尿苷溶液，每次加入溶液后靜置3 min，在 CD上測(cè)定190～250 nm范圍內(nèi)的圓二色譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 4-硫-5-碘尿嘧啶核苷與HSA相互作用的紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)中包含3個(gè)殘基:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，由于它們的生色基團(tuán)不同而有不同的紫外吸收，其中Trp以及Tyr在280 nm波長(zhǎng)附近有一個(gè)吸收峰[21]。圖2為在HSA中加入不同量比的4－硫－5－碘尿苷后，280 nm下的吸光度值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，加入4－硫－5－碘尿苷后，HSA的吸光度值有規(guī)律地下降，因此可以初步判定，4－硫－5－碘尿苷與 HSA之間有結(jié)合，發(fā)生了相互作用[22]。

圖2 HSA－(4－硫－5－碘尿苷)體系的紫外吸收光譜 (T=298 K)。Fig.2 UV absorption spectra of HSA－ISU system(T=298K).

3.2 4-硫-5-碘尿苷與HSA相互作用的熒光光譜

圖3 HSA－4－硫－5－碘尿苷體系的熒光光譜。Fig.3 Emission spectra of HSA in the presence of various concentrations of 4－SIU.

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來(lái)源于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)3個(gè)殘基，三者的熒光發(fā)射峰是相互重疊的。由于蛋白質(zhì)的熒光通常在280 nm或更長(zhǎng)的波長(zhǎng)被激發(fā)，而Phe在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件下不能被激發(fā)，所以很少能觀察到Phe的發(fā)射，這樣蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來(lái)自Trp和 Tyr殘基[23]。從圖3可知，使用280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，HSA的熒光發(fā)射峰主要來(lái)自于Trp和 Tyr殘基，而4－硫－5－碘尿苷在掃描范圍內(nèi)基本無(wú)熒光;隨著 4－硫－5－碘尿苷的加入，HSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律降低，說(shuō)明4－硫－5－碘尿苷能使HSA的熒光猝滅，兩者之間存在相互作用，我們將進(jìn)一步對(duì)其熒光猝滅機(jī)理進(jìn)行探討。

3.3 熒光猝滅機(jī)理

3.3.1 4－硫－5－碘尿苷與 HSA 的猝滅常數(shù)

導(dǎo)致HSA熒光猝滅的原因可能為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是由于猝滅劑和熒光分子間的彼此擴(kuò)散和碰撞而導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度減弱，是一種能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性。靜態(tài)猝滅則是由于發(fā)生了配合作用，通常是生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度減弱。對(duì)于靜態(tài)猝滅，溫度升高會(huì)導(dǎo)致基態(tài)配合物的穩(wěn)定性下降，因此靜態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而下降。為證實(shí)4－硫－5－碘尿苷的猝滅過(guò)程，將此過(guò)程按動(dòng)態(tài) Stern－Volmer方程處理[24]:

式中F和F0分別為加入和不加入藥物HSA溶液的熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù);τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體分子平均的壽命(生物大分子τ0約為10 ns)，在沒有猝滅劑存在的情況下，HSA 的熒光壽命 τ0=1.77 ns;[Q]為猝滅劑(4－SIU)的濃度;Ksv稱為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。滴定時(shí)，4－硫－5－碘尿苷總體積小于 50 μL，遠(yuǎn)小于 HSA 的總體積(2.5 mL)，可忽略體積變化。圖4為不同溫度下，F(xiàn)0/F 隨 4－硫－5－碘尿苷濃度變化的 Stern－Volmer圖，由圖中直線斜率可求出Ksv及Kq，結(jié)果如表1所示。

圖4 不同溫度下的4－SIU－HSA的Stern－Volmer曲線Fig.4 Stern－Volmer plots for the quenching of HSA fluorescence by 4－SIU－HSA at three different temperatures

通常動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而增大，表1結(jié)果表明，隨著溫度的升高，4－SIU－HSA體系的Ksv反而減小，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù) Kq=2.0×1010L·mol－1·s－1[25]。因此，可以推斷 4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白體系的猝滅過(guò)程為形成配合物所引起的靜態(tài)猝滅，不是擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下4-硫-5-碘尿苷與HSA的猝滅反應(yīng)參數(shù)Table 1 Quenching reactive parameters of HSA and ISU at different temperatures

3.3.2 人血清白蛋白與 4－硫－5－碘尿苷相互作用的結(jié)合常數(shù)

根據(jù) Lineweaver－Burk 方程[26]

由(F0－F)－1對(duì)[Q]－1作 Lineweaver－Burk 雙倒數(shù)圖。從圖5可以看出曲線的線性關(guān)系良好，曲線的斜率隨著溫度的升高有所降低，通過(guò)直線斜率的倒數(shù)可分別求出不同溫度下的4－SIU與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)及相關(guān)系數(shù)(見表1)，由結(jié)合常數(shù)可知4－SIU－HSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合力，并且受溫度影響不大，說(shuō)明4－SIU可在體內(nèi)被蛋白質(zhì)貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖5 不同溫度4－硫－5－碘尿苷與 HSA 的 Lineweaver－Burk曲線圖Fig.5 Lineweaver－Burk line for the interaction HSA and 4－SIU

3.3.3 4－硫－5－碘尿苷與人血清蛋白之間的作用力

藥物小分子與生物大分子間的相互作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力及疏水作用力。通過(guò)反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)(如焓變(ΔH)和熵變(ΔS))的變化可以判斷藥物與蛋白質(zhì)間作用力類型:△H＞0，△S＞0為疏水作用力;△H ＜0，△S＜0為氫鍵和范德華力;△H≈0或較小，△S＞0為靜電引力。對(duì)此我們研究了不同溫度條件下二者的結(jié)合常數(shù)，選擇的溫度范圍為15～45℃，此時(shí)HSA不經(jīng)受任何結(jié)構(gòu)的降解，當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的ΔH可以看作常數(shù)。根據(jù)Van't Hoff定律[27]:

在式(3)、(4)中，K為對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)。由lnK對(duì)1/T作圖6。

圖6 不同溫度4－SIU－HSA的Van't Hoff曲線圖Fig.6 Van't Hoff plot for the interaction of HSA and 4－SIU－HSA

由直線斜率和截距可以計(jì)算出ΔH和ΔS的值，通過(guò)式(4)可以計(jì)算出不同溫度下反應(yīng)的ΔG。結(jié)果見表2。

表2 4-SIU與人血清白蛋白體系的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 The related thermodynamic parameters of the 4－SIU HSA system at different temperatures

由表2 中數(shù)據(jù)可以看出，4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白相互作用過(guò)程中的ΔG為負(fù)值。從熱力學(xué)角度來(lái)看，ΔG ＜0，說(shuō)明4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白之間的結(jié)合反應(yīng)能夠自發(fā)進(jìn)行。ΔH＞0，ΔS ＞0，表明 4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白之間的作用力為典型的疏水作用力。

3.3.4 4－硫－5－碘－尿苷與 HSA 之間的能量轉(zhuǎn)移

通過(guò)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，可以求出小分子(受體)在蛋白質(zhì)上的結(jié)合位置和與蛋白質(zhì)分子(供體)中產(chǎn)生熒光的基團(tuán)之間的距離。理論指出發(fā)生能量轉(zhuǎn)移需要滿足以下3個(gè)條件[27]:(1)供體必須發(fā)射熒光;(2)供體的熒光發(fā)射光譜和受體吸收光譜之間有適當(dāng)?shù)闹丿B;(3)供體與受體之間的距離r范圍為2～8 nm。

當(dāng)能量供體和受體分子間距離為r及能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0及能量轉(zhuǎn)移效率E之間有如下關(guān)系[28]:

其中F0為供體的熒光強(qiáng)度;F為供體和受體濃度為1∶1時(shí)的熒光強(qiáng)度;K2指偶極空間取向因子，取給體與受體各向隨機(jī)分布的平均值2/3;N指介質(zhì)的折射指數(shù)，取水和有機(jī)物的平均值1.336;φ為無(wú)受體存在時(shí)能量給體的熒光量子產(chǎn)率，取HSA 中 Trp 的量子產(chǎn)率為 0.118[29];J 表示給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜之間譜線的重疊的部分(圖7中陰影部分);F(λ)為熒光給體在波長(zhǎng)為λ時(shí)的熒光強(qiáng)度;ε(λ)為受體在波長(zhǎng)為λ時(shí)的摩爾消光系數(shù)。

根據(jù)圖7可以得到 J=3.66×10－14cm3·L·mol－1，代入式(5) 和(6) 得到 R0=2.13 nm，r=3.01 nm。2 nm ＜r＜8 nm 且滿足0.5R0＜r＜1.5R0[30]，說(shuō)明HSA與ISU間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移[31]，為 4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白之間存在猝滅作用提供了理論依據(jù)。

圖7 HSA的熒光發(fā)射光譜和4－硫－5－碘尿苷的紫外吸收光譜(T=298 K)，c(HSA)=c(4－硫－5－碘尿苷)=1 μmol/L。Fig.7 Fluorescence emission spectra for HSA and UV absorbance spectra for ISU(T=298 K)，c(HSA)=c(ISU)=1.0 μmol/L.

3.4 4-硫-5-碘尿苷與人血清蛋白之間的圓二色光譜

圓二色光譜可以靈敏地檢測(cè)一些反應(yīng)引起的蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)(如 α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)卷曲等)的變化。圖8為4－硫－5－碘尿苷與HSA作用后的CD圖。圖中在208 nm和222 nm出現(xiàn)2個(gè)負(fù)槽，這是典型α－螺旋結(jié)構(gòu)的CD光譜信號(hào)。當(dāng)4－硫－5－碘尿苷的濃度從 2.0 μmol/L 逐漸增加至14 μmol/L時(shí)，圓二色譜圖基本沒有發(fā)生變化(圖8)。結(jié)果表明，4－硫－5－碘尿苷對(duì)人血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本沒有改變，其通過(guò)血液作用于腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中對(duì)人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)影響很小，表明HSA是一種可以安全攜帶4－硫－5－碘尿苷藥物達(dá)到患處的載體蛋白[32]。

圖8 4－SIU與HSA相互作用的CD光譜圖Fig.8 Circular dichroism spectra of 4－SIU－HSA

4 結(jié) 論

基于硫堿基(thio－base)的易烷基化、易氧化、強(qiáng)紫外長(zhǎng)波(UVA)吸收等獨(dú)特的性質(zhì)，以及核苷類化合物的抗腫瘤活性，設(shè)計(jì)合成了一種新化合物4－硫－5－碘尿苷。實(shí)驗(yàn)以及理論計(jì)算的結(jié)果表明4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅機(jī)制，二者主要靠疏水作用力結(jié)合。圓二色數(shù)據(jù)顯示4－硫－5－碘尿苷對(duì)HSA的二組結(jié)構(gòu)發(fā)生極其微弱的改變，表明此種抗癌藥物在人體內(nèi)只改變氨基酸所處的微環(huán)境，在把藥物安全輸送到腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，4－硫－5－碘尿苷對(duì)HSA沒有毒害作用。4－硫－5－碘尿苷與血液中其它蛋白的相互作用有待于進(jìn)一步的研究，以闡明它的毒理機(jī)制。

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