Fgfr2 S252W突變小鼠下頜切牙改變的研究

周霞，王金川，蒲東全，行勇軍，安建平，劉魯川，鄧蔓菁

Fgfr2 S252W突變小鼠下頜切牙改變的研究

周霞，王金川，蒲東全，行勇軍，安建平，劉魯川，鄧蔓菁

目的對比野生型和成纖維細胞生長因子受體2(Fgfr2)基因S252W突變型小鼠下頜切牙表型的差異，探討Fgfr2功能獲得性突變對小鼠下頜切牙的影響。方法將EⅡa-Cre雄鼠與Fgfr2S252W-neo/+雌鼠交配，子代獲得Fgfr2 S252W突變小鼠。在出生后56d(P56)取材進行Micro-CT、HE染色及鈣黃綠素?zé)晒怆p標檢測，分別檢測下頜切牙的大體形態(tài)、組織形態(tài)及牙齒礦化速率。結(jié)果新生突變小鼠即呈現(xiàn)出短顱畸形，56d時表現(xiàn)更為明顯，Micro-CT顯示突變小鼠的下頜切牙伸長及反畸形明顯。HE染色顯示突變小鼠成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞數(shù)目增多，形態(tài)多不規(guī)則，內(nèi)釉上皮、外釉上皮形成的上皮隔皺縮。鈣黃綠素?zé)晒怆p標檢測顯示突變小鼠牙本質(zhì)礦化生長速率明顯高于對照小鼠。結(jié)論Fgfr2 S252W點突變對小鼠下頜切牙的伸長及反畸形有一定促進作用。

受體，成纖維細胞生長因子，2型；突變；切牙；小鼠

Apert綜合征為多顱縫早閉所致的綜合征，是一種少見的常染色體顯性遺傳疾病，主要由成纖維細胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)gfr2)功能獲得性突變所致[1]，包括S252W和 P253R兩種突變，最早由法國神經(jīng)學(xué)家Apert于1906年報道而命名。其顱面部的臨床表現(xiàn)為顱縫早閉所致的頭顱畸形，突眼和中面部嚴重發(fā)育不良，此外還有嚴重的對稱性并指(趾)畸形[2-4]；中面部凹陷，腭蓋高拱，可有腭裂、牙列擁擠和開，反畸形。Chen等[5]和Wang[6]等分別獨立報道了其建立了Fgfr2 S252W突變型小鼠模型，研究人員在研究Fgfr2 S252W點突變小鼠骨組織異常機制的同時，觀察到部分小鼠的牙齒特別是可以直視的下頜切牙伸長、反，影響進食。目前有關(guān)Fgfr2 S252W突變對骨組織生長發(fā)育調(diào)控作用的研究較多[7-10]，而對牙發(fā)育及功能的影響研究甚少，其機制尚不清楚。本實驗對比觀察了Fgfr2 S252W突變型與野生型小鼠下頜切牙的表型差異，旨在探討Fgfr2 S252W點突變與小鼠下頜切牙異常的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 Fgfr2 S252W功能獲得性點突變小鼠的繁殖與鑒定 Fgfr2 S252W功能獲得性點突變小鼠從美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)引入后，將雌性帶neo基因+突變Fgfr2的基因工程小鼠和雄性EⅡa-Cre小鼠交配，在子代中獲得約1/4數(shù)量的Fgfr2 S252W功能獲得性突變小鼠。在納入實驗前，提取小鼠腳趾DNA進行PCR基因型鑒定，按照基因型分為對照型(+/+)和突變型(S252W/+)兩組。以上小鼠均在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心SPF級動物室分籠飼養(yǎng)，給予12h:12h節(jié)律光照，室溫22℃，濕度50%～55%，自由進食、飲水。經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物管理委員會許可[執(zhí)行標準SYXK(軍2002032)]對實驗動物進行操作。

1.2 基因型鑒定 提取小鼠腳趾基因組DNA，采用引物R2-I6F1：5'-TAGGTAGTCCATAACTCGG-3'和R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATGTGGGGC-3'鑒定Fgfr2 S252W點突變小鼠。使用rTaq PCR試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)體系總體積為25μl。突變基因型為雙條帶(460bp和520bp)，對照組野生型為單條帶(460bp)。

1.3 出生后56d(P56)突變小鼠與同窩野生對照小鼠取材檢測

1.3.1 Micro-CT 本實驗所用顯微CT為美國GE公司開發(fā)的explore Locus SP型產(chǎn)品。掃描參數(shù)如下：電壓80kV，電流80μA，掃描方式360°旋轉(zhuǎn)，掃描時間270min，平均4幀，角度增益0.4°，曝光時間3000ms，分辨率7.0μm×7.0μm×7.0μm。以Flur方式進行掃描，同時掃描標準體模，以備CT值校正。

1.3.2 HE染色 新鮮取材單側(cè)完整下頜骨(含牙)的組織經(jīng)4%多聚甲醛(PFA)4℃固定過夜，0.5mol/L EDTA脫鈣14～20d，流水沖洗過夜。梯度乙醇脫水(70%、80%、90%、100%、100%各1h)，二甲苯透明(2次各30min)。石蠟包埋，制備5μm切片，37℃干燥過夜。常規(guī)行HE染色。

1.3.3 鈣黃綠素(calcein)熒光雙標檢測礦化沉積率(mineral apposition rate，MAR) 選取同窩突變型和野生型小鼠8對，P18和P23腹腔注射鈣黃綠素(25mg/kg，Sigma-Aldrich)。2d后處死小鼠，解剖分離包含牙列的單側(cè)完整下頜骨。系列乙醇4℃脫水，塑化劑溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ浸透包埋，至完全凝固。5μm冠狀切片，通過第一磨牙近中面，做持續(xù)萌出切牙的縱斷切面。熒光顯微鏡下觀察，拍片。激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長510nm。采用專業(yè)圖像分析軟件(Image-Pro Plus，IPP)計量分析2條熒光帶之間的平均距離，所得值除以標記間隔日數(shù)即為MAR，單位為μm/d。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，正態(tài)分布的樣本數(shù)據(jù)兩組間比較采用t檢驗，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 突變小鼠基因型鑒定結(jié)果 突變小鼠基因型鑒定電泳圖見圖1，雙條帶為突變基因型，單條帶為對照組野生型。

圖1 兩組小鼠基因型鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoregram of genotype identification of two groups of mice

2.2 小鼠大體觀察及Micro-CT頭顱側(cè)面觀 新生突變小鼠(1d)身材短小，呈現(xiàn)出短顱圓顱畸形；56d時，圓顱表現(xiàn)更為明顯，Micro-CT顯示突變小鼠下頜切牙伸長及反畸形較為明顯(圖2)。

圖2 兩組小鼠大體觀察及Micro-CT頭顱側(cè)面觀Fig.2 General view and Micro-CT side view of head in two groups of mice

2.3 小鼠下頜切牙HE染色結(jié)果 HE染色顯示，對照小鼠成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞呈高柱狀，排列整齊，細胞核位于細胞基底部；突變小鼠成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞數(shù)目增多，形態(tài)多不規(guī)則，細胞核界限不清楚，無極性，排列紊亂，且突變小鼠下頜切牙頸環(huán)縮小，內(nèi)釉上皮、外釉上皮細胞及星網(wǎng)狀層細胞均減少，內(nèi)釉上皮、外釉上皮形成的上皮隔皺縮(圖3)。

圖3 兩組小鼠下頜切牙的HE染色結(jié)果(右側(cè)小圖為對應(yīng)左側(cè)局部放大圖)Fig.3 HE staining of mandibular incisors of two groups of mice

2.4 小鼠牙本質(zhì)熒光雙標檢測結(jié)果 鈣黃綠素?zé)晒怆p標檢測顯示，突變小鼠與對照小鼠MAR分別為1.22±0.14μm/d、0.93±0.13μm/d，突變小鼠牙本質(zhì)礦化生長速率明顯高于對照小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 兩組小鼠牙本質(zhì)熒光雙標圖(P56)Fig.4 Double fluorescence labelling of dentin of two groups of mice

3 討 論

為克服Apert綜合征患者病例少，年齡、遺傳背景差異大，以及缺乏相似背景正常對照人群的不足之處，最早由Chen等[5]所在實驗室用基因敲入技術(shù)建立了基于Cre-LoxP系統(tǒng)的模式動物——模擬人Apert綜合征的小鼠模型(Fgfr2 S252W突變引起)。為了解該模型小鼠的頭顱發(fā)育畸形是否與人類Apert綜合征類似，杜曉蘭等[11]用客觀、定量的歐幾里得矩陣分析法(Euclidean distance matrix analysis，EDMA)分析了該小鼠的頭顱形態(tài)結(jié)構(gòu)特點，發(fā)現(xiàn)該Apert小鼠有穹隆狀頭顱、牙頜輕度前向錯位、眼距增寬和面部發(fā)育不良等頭顱形態(tài)特征，表明該小鼠模型在頭顱形態(tài)結(jié)構(gòu)上較真實地模擬了人類Apert綜合征的頭顱表型特征。本實驗按照Chen等[5]的方法繁殖的突變小鼠頭顱畸形也具有與人類Apert綜合征患者相似的頭顱表征，其中下頜切牙伸長、反尤為明顯。

尹良軍等[12-13]對Fgfr2 S252W增強型點突變小鼠骨髓基質(zhì)細胞進行體外培養(yǎng)誘導(dǎo)成骨實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gfr2功能持續(xù)增強可能抑制未分化的間充質(zhì)細胞向成骨細胞系的早期分化，但是促進成骨細胞的分化；突變型小鼠長骨骨折愈合過程中，骨痂中軟骨組織形成的時間明顯延遲，軟骨組織鈣化、編織骨形成受阻，軟骨骨痂長期存在，軟骨內(nèi)成骨受到抑制，從而導(dǎo)致骨骼發(fā)育過程中膜內(nèi)骨化過程異常和軟骨內(nèi)骨化過程受到抑制，這兩者的協(xié)同作用構(gòu)成了Apert綜合征多個重要骨骼異常體征的發(fā)病機制。由此可見，F(xiàn)gfr2 S252W突變通過對成骨細胞和軟骨細胞的作用而抑制骨的生長發(fā)育，但本實驗觀察到的下頜切牙過度生長也是突變的促進作用所致。骨和牙同為機體硬組織，同一突變卻起到了相反的作用，其中的機制與聯(lián)系還有待進一步深入研究。

以往研究顯示，在牙胚發(fā)育的蕾狀期、帽狀期、鐘狀期等，F(xiàn)GFs/FGFR2都發(fā)揮正常的調(diào)控作用，一旦FGFR2功能增強，失去平衡，勢必會影響牙齒的正常發(fā)育。本實驗中Fgfr2 S252W突變小鼠下頜切牙根尖上皮隔皺縮，根尖孔變大，血供營養(yǎng)相對豐富，促進前成牙本質(zhì)細胞、前成釉細胞向成牙本質(zhì)細胞、成釉細胞分化，可能造成了HE染色結(jié)果中成牙本質(zhì)細胞、成釉細胞數(shù)目增多以及大體觀察中突變小鼠下頜切牙生長過快導(dǎo)致的伸長及反現(xiàn)象，提示Fgfr2 S252W突變對小鼠下頜切牙的生長期有調(diào)控作用，但對早期牙胚(蕾狀期、帽狀期、鐘狀期)發(fā)育的調(diào)控機制如何，還有待進一步研究。

建立疾病小鼠模型的目的是研究疾病發(fā)生機制及尋找治療措施。在前期研究中，Chen等[5]發(fā)現(xiàn)Fgfr2 S252W突變所致的Apert綜合征頭顱異常主要與顱骨成骨細胞分化、凋亡異常有關(guān)。理論上講，可以通過糾正這些異常來緩解Apert綜合征的顱骨發(fā)育畸形，但這些措施往往缺乏細胞靶向性，且有的措施如抑制細胞凋亡等因為可能存在潛在的致癌性等而難以應(yīng)用。由于Apert綜合征的最根本原因是FGFR2突變后功能增強，提示只要降低或阻斷增強的FGFR2信號就可從源頭上消除病因，達到緩解或治療Apert綜合征切牙長冠、反畸形的目的。2007年Shukla等[14]通過小鼠間交配將建立的針對Fgfr2 S252W突變的RNAi轉(zhuǎn)基因引入Fgfr2 S252W點突變小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該小鼠頭顱畸形基本消失。雖然該法是通過遺傳交配實現(xiàn)，在臨床上不可行，但其實驗結(jié)果除提示可針對功能增強型點突變所致遺傳病進行RNAi治療外，也進一步證明可通過降低FGFR2信號強度來緩解和治療Apert綜合征引起的頭顱畸形，下頜切牙伸長及反畸形也可得到改善。

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Changes of mandibular incisor in Fgfr2 S252W mutant mice

ZHOU Xia1, WANG Jin-chuan1, PU Dong-quan2, XING Yong-jun1, AN Jian-ping1, LIU Lu-chuan1, DENG Man-jing1*
1Department of Stomatology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
2Medical Team, The No.77289 Army of PLA, Kunming 650225, China
*

, E-mail: iradeng@163.com
This work was supported by the Natural Science Foundation Project of Chongqing (2009AC5019, 2011BA5013)

ObjectiveTo compare the phenotypic differences of mandibular incisor between the wild-type mice and fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) gene S252W mutant mice, and explore the influence of gain-of-function mutation in Fgfr2 gene on mandibular incisors in mice.MethodsThe male EⅡa-Cre mice were mated with Fgfr2S252W-neo/+females to obtain the Fgfr2 S252W mutant mice. On the 56th day after offspring's birth (P56), samples were taken for Micro-CT, HE staining and calcein double fluorescent labeling to observe the gross appearance, tissue morphology and mineral apposition rate of mandibular incisors, respectively.ResultsThe newborn mutant mice showed short cranial deformity, which became more obvious on P56. Micro-CT showed a significant elongation and cross-bite deformity of mandibular incisors. HE staining showed that there were more ameloblasts and odontoblasts in the mutant mice, mostly with irregular appearance; epithelial diaphragm composed of inner and outer enamel epithelium shrank. Calcein double fluorescent labeling showed that the mineral apposition rate of dentin in mutant mice was significantly higher than that in controls.ConclusionFgfr2 S252W mutation accelerates the growth of mandibular incisors in mice, resulting in the elongation and cross-bite deformity of mandibular incisors.

receptor, fibroblast growth factor, type 2; mutation; incisor; mice

R780.2

A

0577-7402(2013)10-0807-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.005

2013-03-15；

2013-07-13)

(責(zé)任編輯：張小利)

重慶市自然科學(xué)基金(2009AC5019，2011BA5013)

周霞，醫(yī)學(xué)博士。主要從事牙體牙髓牙周病的研究

400042 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所口腔科(周霞、王金川、行勇軍、安建平、劉魯川、鄧蔓菁)；650225 昆明 解放軍77289部隊衛(wèi)生隊(蒲東全)

鄧蔓菁，E-mail：iradeng@163.com