青藏高原禽源多殺性巴氏桿菌ompH基因的克隆及序列分析

安 娜，張紅見(jiàn)，劉光輝，趙 靜，陳 剛

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810003）

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起的雞和火雞等禽類(lèi)的一種接觸性傳染病。目前控制多殺性巴氏桿菌病的疫苗主要有強(qiáng)毒的滅活菌苗，弱毒活菌苗，這些疫苗在一定程度上對(duì)多殺性巴氏桿菌病的防治起到了一定的作用，但因多殺性巴氏桿菌的毒力因子具有多樣性、血清型多、免疫譜窄、保護(hù)期較短以及易產(chǎn)生耐藥性等原因［1］，以致本病仍未能得到有效的控制，特別是在青海省每年都有散在發(fā)生，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

外膜蛋白H是多殺性巴氏桿菌最主要的外膜蛋白，屬于孔蛋白，其所具有的性質(zhì)均提示孔蛋白能夠成為既能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生同源保護(hù)又能產(chǎn)生異源保護(hù)的一種良好的候選疫苗［2］。本試驗(yàn)選擇禽源多殺性巴氏桿菌分離株的ompH基因作為研究對(duì)象，以期了解青藏高原禽源Pm與其他菌株在遺傳特點(diǎn)、進(jìn)化規(guī)律上的關(guān)系，以及ompH應(yīng)用于疫苗的可行性，為研制更為有效的禽類(lèi)地方血清型亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株：C47-8（牛源），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；野生菌株分離自西寧市某雞場(chǎng)病死雞肝臟；對(duì)照菌株：肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）、大腸埃希菌（ATCC25922）、傷寒沙門(mén)菌（ATCC 14028），均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室饋贈(zèng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的多殺性巴氏桿菌ompH基因保守序列，采用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)引物ompH3，引物 序 列 如 下：Forward Primer 5′-AGCAGTAGCAGCAACTTCAGCAAA-3′；Reverse Primer 5′-CCC-GCACCTAAGATGATAGCACGA-3′，目 的基因片段長(zhǎng)度928bp，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 菌株模板DNA的抽提 C47-8、對(duì)照菌及P1004模板DNA的抽提操作步驟依照TaKaRa公司生產(chǎn)的MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 PCR反應(yīng)條件及體系 PCR反應(yīng)體系：50μL反應(yīng)體系：加入Premix Taq25μL，F(xiàn)orward Primer 1μL，Reverse Primer 1μL，模板 DNA 1μL，ddH2O 22μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30 s，72℃1min，72℃10min，4℃5min共30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 P1004ompH基因的克隆 將回收的擴(kuò)增片段連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12～16h，將疑似陽(yáng)性克隆的白斑選出，轉(zhuǎn)接到新的Amp＋的平板中37℃培養(yǎng)12h，將經(jīng)過(guò)PCR鑒定的陽(yáng)性克隆菌液送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序3次，將禽源Pm的ompH序列與GenBank上公布的C47-8及9個(gè)國(guó)內(nèi)外代表株進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 ompH基因的擴(kuò)增 用自行設(shè)計(jì)的ompH3引物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株C47-8、陰性對(duì)照菌株肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌、傷寒沙門(mén)菌和P1004進(jìn)行ompH基因的PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期結(jié)果相符的928bp的目的片段，作為陰性對(duì)照的肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌和傷寒沙門(mén)菌均未擴(kuò)出（見(jiàn)圖1、圖2）。

2.2 P1004ompH基因的鑒定 將回收后的P1004株和C47-8菌株的PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取單個(gè)白色菌落，轉(zhuǎn)接到新的Amp＋的平板中37℃培養(yǎng)12h后，進(jìn)行PCR鑒定，均擴(kuò)增到了預(yù)期的片段，然后送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.3 測(cè)序及同源性分析

2.3.1 禽源P1004ompH基因編碼區(qū)核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株及國(guó)內(nèi)外代表株同源性比較結(jié)果，見(jiàn)表1。

將禽源多殺性巴氏桿菌ompH基因編碼區(qū)核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株及國(guó)內(nèi)外代表株同源性進(jìn)行比較，結(jié)果禽源P1004菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株C47-8之間的ompH基因編碼區(qū)核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為62%和91.7%，表明此次分離的禽源Pm菌株ompH基因序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株C47-8之間存在明顯差異；禽源多殺性巴氏桿菌P1004ompH基因序列與GenBank中公布的國(guó)外代 表 毒 株 AY603962、AY864815、DQ054529、DQ415729、EF635423、DQ417895、EU016232、U50907和PMU52200的同源性在55.9%～65.2%之間，其中最低的是與PMU50907，同源性為55.9%；最高的是DQ417895，同源性也僅為65.2%。以上分析結(jié)果顯示，禽源多殺性巴氏桿菌P1004ompH基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性與國(guó)內(nèi)外大部分多殺性巴氏桿菌菌株ompH基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性差異較大。

2.3.2 ompH基因編碼區(qū)核苷酸與其推導(dǎo)的氨基酸序列比較結(jié)果 經(jīng)核苷酸序列比較，結(jié)果顯示，P1004和C47-8的序列差別很大，在第129等141個(gè)位點(diǎn)上都存在變異，在506～507位點(diǎn)發(fā)生基因缺失；與國(guó)內(nèi)代表株AY864815和EF635423相比，在第54位等92個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，506～507位上出現(xiàn)基因缺失；與國(guó)外代表株AY603963和DQ054529相比，在第88位等79個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，在506～507位基因缺失；由圖3可知，將P1004和C47-8 ompH基因推導(dǎo)的氨基酸序列比較分析，顯示其氨基酸序列與C47-8同源性較高，為91.7%。在第21位等25個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，在第66位等134個(gè)位點(diǎn)發(fā)生基因缺失；與國(guó)內(nèi)代表株AY864815和EF635423相比，在21、72、128、135～136、157位發(fā)生變異，在66～68、170～298位發(fā)生缺失；與國(guó)外代表株AY603963和DQ054529相比，在第21位等22個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，在170～298位發(fā)生基因缺失。

表1 11株多殺性巴氏桿菌ompH基因編碼區(qū)核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性

圖3 11株多殺性巴氏桿菌ompH基因編碼區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)圖

3 討論

3.1 據(jù)報(bào)道，純化的ompH能誘導(dǎo)100%保護(hù)率，與全菌誘導(dǎo)的保護(hù)率相當(dāng)［3］；ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，ompH和全菌都能誘導(dǎo)高水平的抗體。在同種菌的不同菌株中，孔蛋白的一級(jí)氨基酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)及與抗原性有關(guān)的區(qū)域相對(duì)保守［4］，ompH蛋白的這一特性為多殺性巴氏桿菌的鑒定及保護(hù)性抗原片段的篩選提供了一個(gè)新的方向，使ompH有望成為一種對(duì)所有血清型的Pm產(chǎn)生保護(hù)的候選抗原。

3.2 曹素芳等曾將血清A群的禽巴氏桿菌C48-1株ompH基因與已知的15個(gè)血清型及疫苗株CU的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列比較，核苷酸同源性在51.5% ～98.7%之間，氨基酸同源性在39.3%～98.7%之間［1］.本試驗(yàn)中P1004和標(biāo)準(zhǔn)菌株C47-8的ompH基因編碼區(qū)核苷酸序列的同源性為62%，氨基酸序列的同源性為91.7%；與已知的9個(gè)國(guó)內(nèi)外代表株進(jìn)行比對(duì)分析，核苷酸同源性在55.9%～65.2%之間，說(shuō)明禽源Pm ompH基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性與國(guó)內(nèi)外大部分Pm菌株ompH基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性差異大。但是氨基酸序列比較結(jié)果顯示，不同血清型菌株的ompH同源性很高，在91.3%～91.7%之間，提示ompH作為疫苗使用可能提供同源和異源保護(hù)，但有待進(jìn)一步進(jìn)行表達(dá)及免疫保護(hù)試驗(yàn)研究。

［1］王娉，張富春.多殺性巴氏桿菌毒力因子的研究進(jìn)展［J］.地方病通報(bào)，2006，21（2）.

［2］Luo Y，Glisson J R，JackwoodM W，et al.Cloning and characterization of the major outermembrane p rotein gene（om pH）of Pasteurella m ultocida X-73［J］.J Bacteriol，1997，179：7856-7864.

［3］Galdiero M，F(xiàn)olgore A，Nuzzo，et al.Adhesion and Transmigration Through Bovine Endothelial Cells in vitro by Protein H and LPS of Pasteurella m ultocida［J］.Immunobiology，2000，202（3）：226-238.

［4］曹素芳，黃青云，韓先干，等.禽巴氏桿菌C48-1外膜蛋白H基因克隆及序列分析［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（3）：253-256.