微生物酶高效異源表達(dá)策略的最新研究進(jìn)展

楊海泉，劉 龍，李江華，堵國成,*，陳 堅

(1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗室，江蘇 無錫 214122)

酶作為生物催化劑可應(yīng)用于多個領(lǐng)域，酶的產(chǎn)率、產(chǎn)量、品質(zhì)和功能是酶應(yīng)用于工業(yè)中的重要決定因素[1]。酶的高效表達(dá)與多個因素相關(guān)：宿主的細(xì)胞生長特性、表達(dá)水平、胞內(nèi)/胞外表達(dá)模式、翻譯后修飾、活性蛋白等。為了實(shí)現(xiàn)酶的高效表達(dá)，酶表達(dá)系統(tǒng)的選擇至關(guān)重要。重組酶已在多個宿主中成功表達(dá)，如大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、絲狀真菌、乳酸菌[2-6]。由于外源基因或表達(dá)宿主性質(zhì)與功能的多樣性以及在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不能合理監(jiān)控其生理變化，目的蛋白基因在表達(dá)宿主中很難實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，酶的工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。針對上述問題，本文主要總結(jié)了用于工業(yè)酶過量表達(dá)的不同微生物宿主及實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)的最新方法策略等。

1 不同表達(dá)宿主在異源表達(dá)酶方面的差異

如表1所示，不同表達(dá)系統(tǒng)具有各自相關(guān)特點(diǎn)。E. coli表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為宿主基因組信息清晰、質(zhì)?？截悢?shù)高、突變宿主種類多等[7]。芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為具有高效分泌能力、蛋白酶活性低、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、分泌蛋白可正確折疊、分泌蛋白可溶、分泌蛋白具有生物催化活性[5]。酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為蛋白翻譯后修飾(如糖基化)、高熱耐受性、高鹽耐受性等[8]。絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為可高效表達(dá)大分子真核蛋白、超強(qiáng)分泌蛋白能力、食品安全型宿主等[2]。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)為細(xì)胞膜上沒有毒素，是食品或藥品領(lǐng)域安全表達(dá)宿主[3]。

同時，不同表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)蛋白時，所需培養(yǎng)基及表達(dá)量方面也具有各自相關(guān)特點(diǎn)。E. coli表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為生長速度快、可高密度發(fā)酵、易培養(yǎng)、高產(chǎn)量等。例如，堿性磷酸酶在重組E. coli中表達(dá)量最高可達(dá)5.2g/L[5]。芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為發(fā)酵培養(yǎng)基低廉且寬泛、高效分泌能力等。例如，內(nèi)聚半乳糖醛酸酶在重組B. subtilis中表達(dá)量可達(dá)0.8g/L[9]。酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為菌體生長快速、碳源廉價、高密度發(fā)酵、高熱耐受性、高鹽耐受性、高產(chǎn)量、低生產(chǎn)成本等。例如，鼠標(biāo)膠原在重組P. pastoris中表達(dá)蛋白量最高可達(dá)14.8g/L；其他重組蛋白量最高可達(dá)30g/L[8]。絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為易培養(yǎng)、高產(chǎn)量、高表達(dá)量等。例如，糖化酶在A. niger中表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)30g/L；同時，T. reesei的蛋白表達(dá)量可達(dá)100g/L[2]。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)雖為食品級宿主，但其表達(dá)量低。例如，β-半乳糖苷酶在L. lactis中表達(dá)量可達(dá)0.225U/mL[10]。

表1 不同酶表達(dá)宿主的特點(diǎn)Table 1 Characteristics of different enzyme expression host

不同表達(dá)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)化方法方面存在較大差異。宿主轉(zhuǎn)化方法主要包括化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。E. coli宿主轉(zhuǎn)化時主要采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，該方法簡單易于操作、轉(zhuǎn)化效率高；同時，也采用電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行，該方法操作相對比較簡單、轉(zhuǎn)化效率高[11]。芽孢桿菌宿主常采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化方法相對簡單，轉(zhuǎn)化效率一般；對于該宿主也采用電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法相對比較簡單易于操作；同時，芽孢桿菌也會采用其他相關(guān)方法，如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、重金屬離子轉(zhuǎn)化法等[12]。酵母表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化主要采用電擊轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行，也有少數(shù)采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法(如氯化鋰法)進(jìn)行[13]。絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)采用的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。其中，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的再生頻率低、周期長；醋酸鋰轉(zhuǎn)化法的使用范圍窄；電擊轉(zhuǎn)化法的步驟簡單、效率高；基因槍轉(zhuǎn)化法價格昂貴；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定、成功率高、遺傳穩(wěn)定，為最常用的真菌遺傳轉(zhuǎn)化法[14]。乳酸菌轉(zhuǎn)化主要采用電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行[10]。

2 異源表達(dá)微生物酶的關(guān)鍵問題及相關(guān)解決方案

微生物酶在異源表達(dá)時，常出現(xiàn)蛋白質(zhì)無法正確折疊、不可溶或折疊后缺少糖基化等修飾問題導(dǎo)致形成無活性蛋白甚至包涵體。包涵體具有蛋白不可溶、蛋白表達(dá)量低等缺點(diǎn)。對于表達(dá)后出現(xiàn)包涵體的現(xiàn)象，主要出現(xiàn)在重組E. coli表達(dá)蛋白情況下，其他表達(dá)系統(tǒng)出現(xiàn)包涵體的概率相對較低。包涵體的形成主要由以下條件導(dǎo)致的：表達(dá)量過高、蛋白來源于真核系統(tǒng)表達(dá)時無法糖基化、錯誤折疊分子、重組蛋白含過多含硫氨基酸、培養(yǎng)條件影響(pH值、溫度)、蛋白質(zhì)分子間的作用力(離子鍵、疏水鍵、共價鍵等)等。針對上述問題，減少包涵體的形成常需要優(yōu)化表達(dá)體系及相應(yīng)蛋白。常采用的方法包括：與分子伴侶或折疊酶共表達(dá)、降低重組蛋白合成速率、低溫誘導(dǎo)、誘導(dǎo)劑的劑量和誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)時添加蛋白可溶性添加劑(多醇類、蔗糖、乙醇等)、采用不同質(zhì)粒及表達(dá)宿主、改變蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)氨基酸組成[15-16]。針對缺少糖基化的現(xiàn)象，主要出現(xiàn)來源于真核系統(tǒng)中蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時，這樣的蛋白可以更換成真核表達(dá)宿主(如酵母、絲狀真菌)[2,8]。

胞內(nèi)表達(dá)或分泌表達(dá)對蛋白在異源表達(dá)宿主中表達(dá)具有重要意義。胞內(nèi)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)主要包括：高純度、簡單的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)、較高蛋白表達(dá)量等。但也有其缺點(diǎn)如：易形成包涵體、最終蛋白表達(dá)量低、產(chǎn)品耗費(fèi)高等。分泌表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)為：表達(dá)蛋白純化簡單、蛋白不易水解、促進(jìn)蛋白折疊、蛋白表達(dá)量高等；其缺點(diǎn)為信號肽運(yùn)輸能力有限分泌容易異常、蛋白溶解不易純化等。通過調(diào)控蛋白分泌的關(guān)鍵因素可以提供蛋白的分泌表達(dá)量。調(diào)控蛋白分泌的關(guān)鍵因素主要包括融合宿主相應(yīng)信號肽、融合蛋白、共表達(dá)分泌蛋白、共表達(dá)分子伴侶、添加促進(jìn)分泌成分、采用不同質(zhì)粒及宿主、控制發(fā)酵條件等[1,2,5,7-8]。

3 微生物酶在大腸桿菌中過量表達(dá)策略

E. coli作為酶常用表達(dá)宿主之一，為實(shí)現(xiàn)酶的過量表達(dá)可采用不同的分子操作技術(shù)與發(fā)酵策略。重組酶的表達(dá)調(diào)節(jié)是一個包括諸多相互元素的復(fù)雜系統(tǒng)。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建需要諸多因素，這些因素對于酶的過量表達(dá)水平具有關(guān)鍵意義。E. coli表達(dá)質(zhì)粒主要包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、轉(zhuǎn)錄終止子等。采用強(qiáng)啟動子可以促進(jìn)重組蛋白在E. coli中高效合成。在采用化學(xué)誘導(dǎo)型質(zhì)粒時，采用低溫誘導(dǎo)可以為蛋白重折疊提供足夠的時間實(shí)現(xiàn)活性蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)運(yùn)終止子可以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，增加外源蛋白的表達(dá)水平。同時，反終止子因素的應(yīng)用也有利于外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)。蛋白表達(dá)水平的高低與基因的翻譯水平有重要關(guān)聯(lián)。重組蛋白在E. coli中異源表達(dá)會受到密碼子偏好性的制約，稀有tRNA的競爭可以嚴(yán)重影響基因的表達(dá)水平[17]。非常稀有的精氨酸密碼子AGA和AGG會造成錯誤翻譯，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平低下。通過全基因合成可優(yōu)化表達(dá)基因，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化密碼子和去掉二級結(jié)構(gòu)mRNA[18]。同時，通過對目標(biāo)基因稀有密碼子進(jìn)行突變或共表達(dá)編碼tRNA基因，可以緩解密碼子偏好性。為了表達(dá)可溶性蛋白，主要采用的方法包括低溫培養(yǎng)、表達(dá)DnaK/DnaJ (Hsp70)、不同E. coli宿主選擇、改變pH值、高壓減弱疏水作用、共表達(dá)分子伴侶、調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)Ca2+、限制生長調(diào)節(jié)、共表達(dá)等。為了提高蛋白分泌水平，采取的方法主要有信號肽優(yōu)化、突變信號肽、過量表達(dá)雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(Tat)ABC蛋白、EDTA和溶菌酶的協(xié)調(diào)效應(yīng)、洗滌劑、周質(zhì)空間分子伴侶、融合蛋白、元素(如SDS、甘氨酸、Ca2+、Na+)添加、延長甘氨酸補(bǔ)加率、翻譯調(diào)控、葡萄糖球菌核酸酶的19-殘基前導(dǎo)肽等。

多種融合蛋白和分子伴侶均已應(yīng)用于提高酶的表達(dá)水平。GSF融合常應(yīng)用于提高不同重組蛋白的表達(dá)[19]。蛋白SUMO、TrxA或硫氧還蛋白的融合可以顯著提高重組蛋白在E. coli中的表達(dá)量[20-22]。通過trpE基因片段在翻譯水平的融合可以顯著提高低表達(dá)水平基因的表達(dá)量。同時，分子伴侶對于蛋白在胞內(nèi)的折疊也具有重要意義。通過共表達(dá)2個噬菌體T4編碼分子伴侶可成功生產(chǎn)出可溶性蛋白[23]。通過共表達(dá)鐮狀瘧疾蟲分子伴侶增強(qiáng)了抗瘧疾藥物靶標(biāo)環(huán)化水解酶的表達(dá)量[24]。在發(fā)酵優(yōu)化產(chǎn)酶方面，高密度培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)酶在E. coli中的高效表達(dá)。高密度培養(yǎng)的方法包括分批、分批補(bǔ)料、連續(xù)培養(yǎng)等。限制高密度培養(yǎng)的制約因素(溶解氧、二氧化碳)降低了細(xì)胞生長速率、增加了乙酸的形成、減少了混合效率等。為了降低乙酸的積累，通過代謝工程引入乙酰乳酸合酶可提高重組蛋白的表達(dá)量。

4 微生物酶在芽孢桿菌中過量表達(dá)策略

B. subtilis是又一優(yōu)良蛋白基因異源表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可將蛋白分泌至胞外。在系列B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)中，芽孢菌素調(diào)節(jié)基因表達(dá)系統(tǒng)是最高效的表達(dá)系統(tǒng)。多種重組酶在B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)[4]。B. alcalophilus的堿性淀粉酶在B. subtilis中過量表達(dá)，表達(dá)后酶的產(chǎn)量是野生菌表達(dá)量的76倍[4]。分子伴侶PrsA脂蛋白的過量表達(dá)可以增強(qiáng)B. strearothermophilus淀粉酶在B. subtilis中的分泌[9]。啟動子系統(tǒng)是B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)的重要因素。通過Pglv啟動子多核酸下游轉(zhuǎn)錄區(qū)域位點(diǎn)的定點(diǎn)突變可促進(jìn)其啟動能力。

B. megaterium是一已應(yīng)用于異源蛋白表達(dá)的原核宿主。B. megaterium作為表達(dá)宿主具有很多優(yōu)點(diǎn)，如質(zhì)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、低蛋白酶活性、培養(yǎng)基廣泛等[5]。多種不同異源蛋白已經(jīng)成功在B. megaterium中進(jìn)行表達(dá)[25]。角蛋白酶在啟動子PxylA和PamyL的調(diào)控下，在B. megaterium中成功表達(dá)[26]。為了減弱調(diào)節(jié)子的抑制作用，調(diào)節(jié)子DegSU轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進(jìn)了異源淀粉酶在B. megaterium中的高效分泌[27]。

B. brevis也是一個重要的異源蛋白表達(dá)宿主，酶異源表達(dá)后直接分泌至培養(yǎng)基中高效積累。在B. brevis中異源表達(dá)的酶是可溶的、正確折疊的、具有生物催化活性。B. brevis的胞外蛋白酶表達(dá)水平低下，所以宿主分泌的異源表達(dá)后的酶是穩(wěn)定的、不易被降解[5]。重組磷脂酰肌醇-磷脂酶在B. brevis宿主中成功過量表達(dá)。通過分子工程手段，可以實(shí)現(xiàn)蛋白在B. brevis中的高效分泌。例如，真菌蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的表達(dá)可以增強(qiáng)B. brevis分泌系統(tǒng)的分泌能力。

5 微生物酶在酵母中過量表達(dá)策略

酵母成為重組酶表達(dá)的最適宿主之一，具有基因操作、快速生長、翻譯后修飾(如糖基化)等優(yōu)點(diǎn)。目前，已應(yīng)用于酶表達(dá)的酵母宿主包括：P. pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Arxula adeninivorans、Candida boidinii等[28-34]。為進(jìn)一步提高重組酶的生產(chǎn)，通過分子工程技術(shù)改造酵母宿主獲得多種優(yōu)良宿主[35]。P. pastoris是不同來源微生物酶過量表達(dá)的最常用宿主。應(yīng)用廣泛的P. pastoris表達(dá)宿主包括P. pastoris GS115(營養(yǎng)缺陷型宿主)和P. pastoris SMD1163/1165(蛋白酶缺陷型菌株)。P. pastoris有3種表現(xiàn)型：Mut+、Muts、Mut－。多種重組酶在P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，如Candida rugosa LIP同工酶在重組P. pastoris中成功表達(dá)，產(chǎn)量為在原野生宿主中表達(dá)量的10倍[36]。重組酶在P. pastoris中高效表達(dá)需具備如下因素：序列最優(yōu)化、帶有分泌信號肽、合適表達(dá)質(zhì)粒、最優(yōu)發(fā)酵條件等?？梢酝ㄟ^優(yōu)化P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)，提高其重組酶的表達(dá)量。作為快速、便捷表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒，pBGP1-DEST和pPICZ alpha-DEST主要應(yīng)用于重組P. pastoris中分泌蛋白[37]。不同的誘導(dǎo)方式重組酶表達(dá)量具有較大影響。由于甲醇具有一定毒性，同時在生產(chǎn)過程中甲醇本身具有一定危險性，所以在發(fā)酵方面甲醇誘導(dǎo)不適合于食品領(lǐng)域產(chǎn)品的生產(chǎn)，為此可以采用3-磷酸-甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子。P. pastoris高密度發(fā)酵產(chǎn)酶所需培養(yǎng)基主要包括基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、微量元素、氨水、甘油、甲醇等。氨水作為堿性溶液可用于控制pH值，同時在發(fā)酵后期可用于提高氮源促進(jìn)菌體生長。對于重組蛋白生產(chǎn)過程中甘油濃度過高時，甘油會抑制AOX1啟動子的功能[38]。同時，以山梨醇作為共基質(zhì)具有更為顯著的促進(jìn)蛋白表達(dá)量的效果[18]。由于氧是P. pastoris甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵過程中的必須因素，所以在甲醇利用發(fā)酵過程中需要較高氧傳遞速率[39]。為了提高氧傳遞速率需要高速攪拌和富氧空氣條件，這樣才可能使溶解氧持續(xù)保持在合理水平[39]。在高密度發(fā)酵過程中，酵母分泌的蛋白酶對于重組酶有一定降解作用，這將嚴(yán)重影響酶的產(chǎn)量。為解決上述問題，可以采取如下方法：降低發(fā)酵pH值、添加酪蛋白水解物、改變培養(yǎng)基組成等[18,39]。

S. cerevisiae被認(rèn)為是最安全宿主之一，在該宿主中表達(dá)的酶制劑可應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域。據(jù)報道，已市場化的尿酸氧化酶主要由宿主S. cerevisiae表達(dá)[40]。同時，還有很多重組酶在S. cerevisiae中成功異源表達(dá)的實(shí)例，例如，C. albicans Pma1p(CaPma1p)在S. cerevisiae中成功高效表達(dá)[41]。通過分子改造方法(如融合分子伴侶、基因敲除等)可以提高重組蛋白在S. cerevisiae中高效表達(dá)量。據(jù)報道，以細(xì)胞壁蛋白不同區(qū)域作為翻譯融合伴侶，Paenibacillus barcinonensis內(nèi)切葡聚糖酶在S. cerevisiae中獲得成功表達(dá)[42]。同時，途徑調(diào)節(jié)子Hac1p的調(diào)節(jié)可激活分泌途徑促進(jìn)重組蛋白在S. cerevisiae中的分泌。通過S. cerevisiae突變庫篩選，基因MON2的敲除增強(qiáng)了重組熒光素酶分泌[43]。通過改變培養(yǎng)基的成分也可以促進(jìn)重組S. cerevisiae分泌蛋白。例如，添加含富含氨基酸的培養(yǎng)基可顯著提高S. cerevisiae合成纖維素酶[44]。

H. polymorpha宿主可以合成生產(chǎn)多種酶(如乙醇酸氧化酶、植酸酶等)[45-46]。培養(yǎng)條件(溫度、pH值、培養(yǎng)基組成等)對重組酶表達(dá)量高低具有重要影響。據(jù)報道，重組葡激酶(rSAK)成功在H. polymorpha中表達(dá)，通過發(fā)酵優(yōu)化(溫度、pH值、補(bǔ)料、培養(yǎng)及組成等)后達(dá)到最高產(chǎn)量(1g rSAK-2/L)[46]。Y. lipolytica也逐漸應(yīng)用于大分子重組酶表達(dá)、高效分泌等。Saccharomycopisis fibuligera A11酸性蛋白酶基因(AP1)在Y. lipolytica中過量表達(dá)，表達(dá)量為46.7U/mg[32]。Rhizopus oryzae脂肪酶，在強(qiáng)啟動子XPR2的調(diào)控下在Y. lipolytica P01g中異源表達(dá)[47]。甲基營養(yǎng)型酵母C. biodinii是一種分泌蛋白生產(chǎn)的高效宿主。乙酰亞精胺氧化酶(ASOD)基因在AOD1啟動子調(diào)控下，在C. biodinii中過量表達(dá)[34]。K. lactis已經(jīng)成功應(yīng)用于表達(dá)重組酶制劑如脂肪酶、脫乙酰幾丁質(zhì)酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡糖糖化酶[32,48-50]。少數(shù)重組酶在A. adeninivorans中成功表達(dá)，如丹寧酸酶在A. adeninivorans中已成功表達(dá)[51]。

6 微生物酶在絲狀真菌中過量表達(dá)策略

絲狀真菌可為表達(dá)宿主用于過量生產(chǎn)、分泌蛋白。絲狀真菌是具有高效分泌蛋白潛力的真核表達(dá)系統(tǒng)，能對蛋白進(jìn)行翻譯后修飾等。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)發(fā)酵與其他相關(guān)產(chǎn)業(yè)開始逐漸重視絲狀真菌表達(dá)宿主的研究與應(yīng)用。用于蛋白表達(dá)的絲狀真菌包括Aspergillus、Trichoderma、Penicillium、Rhizopus、Fusarium等[52]。絲狀真菌表達(dá)的異源蛋白主要分為2類：工業(yè)酶制劑和高等生物的基因產(chǎn)物(蛋白藥物等)。絲狀真菌的表達(dá)水平除了少數(shù)蛋白產(chǎn)量偏高外，其他異源蛋白的產(chǎn)量遠(yuǎn)達(dá)不到高水平。為此可以在轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾加工、分泌和胞外降解等不同水平進(jìn)行改造，提高蛋白的表達(dá)量。到目前為止，被開發(fā)用于重組蛋白生產(chǎn)的絲狀真菌宿主并不多。本節(jié)主要探究與分析2個主要宿主Aspergillus和Trichoderm的現(xiàn)狀及前景。

Aspergillus是重要工業(yè)重組酶制劑生產(chǎn)絲狀真菌之一。A. niger和T. reesei等幾種重要真菌中發(fā)展起來的DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)開啟了探索以真菌為蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究新方向[52]。A. niger和A. oryzae是食品安全型宿主，適合生產(chǎn)食品、藥品級酶制劑[53-54]。多種重組蛋白分別在宿主A. niger或A. oryzae中成功異源表達(dá)。糖化酶基因(glaA)已在A. niger中成功過量表達(dá)[55]。據(jù)報道，序列中的酪氨酸和天冬酰胺組成可提高重組蛋白表達(dá)水平[56]。同時，catR啟動子的誘導(dǎo)或抑制作用可用于增強(qiáng)A. niger中重組蛋白的生產(chǎn)[57]。宿主A. oryzae在酶生產(chǎn)方面具有高效生產(chǎn)與分泌能力，也是一株重要蛋白表達(dá)宿主。一種新型細(xì)菌植酸酶成功在宿主A. oryzae中表達(dá)[58]。聚酮合酶(PKS)在啟動子gpdA的作用下，在宿主A. oryzae中成功表達(dá)[59]。

Trichoderma屬表達(dá)宿主主要包括：T. reesei、T. altroviride、T. vireus。在表達(dá)系統(tǒng)T. reesei方面的研究相對較多，但在T. altroviride和T. vireus表達(dá)系統(tǒng)方面的研究尚處在起步階段。據(jù)報道，纖維二糖水解酶cbh1強(qiáng)啟動子可以提高纖維素酶在宿主T. reesei中異源表達(dá)效率[60]。不同表達(dá)質(zhì)粒對酶在宿主T. reesei中異源表達(dá)具有重要影響。Lü等[61]構(gòu)建了2個可應(yīng)用于大分子酶基因表達(dá)的質(zhì)粒(pWEF31、pWEF3)。在強(qiáng)啟動子T. reesei cel7A (chh1)的調(diào)控下，3個來源于Chaetomium thermophilum CBS 730.95的木聚糖內(nèi)切酶基因(Ct xyn11A、Ct xyn11B、Ct xyn11C)在中T. reesei成功表達(dá)[62]。Penicillium oxalicum B3-11內(nèi)切木聚糖酶基因(PoxynA)在強(qiáng)啟動子pdc的調(diào)節(jié)下，在宿主Trichoderma reesei中成功表達(dá)[63]。

7 微生物酶在乳酸菌中過量表達(dá)策略

隨著生物技術(shù)、基因組、蛋白組等技術(shù)的發(fā)展，乳酸菌逐漸成為在重組蛋白高效表達(dá)方面非常具潛力宿主之一。乳酸菌細(xì)胞膜上沒有毒素，其表達(dá)的產(chǎn)物直接與人類健康有關(guān)系。因此乳酸菌成為食品安全級微生物，可應(yīng)用于食品工業(yè)和生物制藥等領(lǐng)域重組蛋白表達(dá)[64]。關(guān)于乳酸菌異源表達(dá)蛋白的一些關(guān)鍵技術(shù)已經(jīng)相繼出現(xiàn)，主要包括：不同誘導(dǎo)系統(tǒng)、不同表達(dá)系統(tǒng)、調(diào)控系統(tǒng)、菌株修飾、表達(dá)質(zhì)粒、啟動子、增強(qiáng)誘導(dǎo)、分泌系統(tǒng)等[3,65]。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)具有多種食品級選擇標(biāo)記，主要包括：糖類選擇標(biāo)記(乳糖選擇標(biāo)記、D-木糖選擇標(biāo)記、蔗糖選擇標(biāo)記等)、細(xì)菌素抗性選擇標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記、抗金屬離子選擇標(biāo)記和噬菌體選擇標(biāo)記等[66-67]。

在乳酸菌中，L. lactis是一株目前乳酸菌中常用于重組蛋白表達(dá)的菌株。多種重組蛋白已經(jīng)在L. lactis中成功異源表達(dá)。過敏原蛋白基因與質(zhì)粒pNSH重組后，在重組L. lactis NZ9000中成功表達(dá)[68]。同時，已有不同誘導(dǎo)系統(tǒng)用于在L. lactis中重組蛋白表達(dá)。例如，乳酸鏈球菌肽誘導(dǎo)型調(diào)控基因廣泛應(yīng)用于L. lactis的誘導(dǎo)系統(tǒng)中[69]，這個系統(tǒng)提供了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目刂票磉_(dá)系統(tǒng)和蛋白表達(dá)系統(tǒng)。另外，出現(xiàn)了一些選擇性誘導(dǎo)系統(tǒng)。Bifi dobacterium longum NRRL B-41409 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-AI)被克隆后，在L. lactis中通過磷酸-消耗-誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)[70]。L. brevis S蛋白基因在木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(XIES)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下成功表達(dá)后并分泌至胞外[71]。研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)包含5’-非翻譯前導(dǎo)序列mRNA的穩(wěn)定性可以提高重組淀粉酶在L. lactis中的表達(dá)量[72]。分泌水平是提高重組酶在L. lactis中高效表達(dá)的另一個關(guān)鍵因素。Baradaran等[73]成功將2條Pediococcus pentosaceus信號肽與蛋白融合在L. lactis中表達(dá)，成功獲得分泌蛋白。在L. lactis表達(dá)系統(tǒng)中采用啟動子Pnisz和信號肽SPUsp，可以獲得可溶性、分泌蛋白。例如，Liang等[74]將納豆激酶基因轉(zhuǎn)入L. lactis中成功表達(dá)后，產(chǎn)生的重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中，酶活力可達(dá)41.7U/mL。Drouault等[75]利用乳酸乳球菌NICE表達(dá)系統(tǒng)成功誘導(dǎo)表達(dá)了豬葡萄球菌脂肪酸，口服給藥用于治療脂肪痢。

8 結(jié) 語

重組微生物酶制劑已分別可以在細(xì)菌、真菌等微生物表達(dá)系統(tǒng)中過量表達(dá)。分析發(fā)現(xiàn)，E. coli表達(dá)系統(tǒng)在微生物酶制劑表達(dá)系統(tǒng)中仍占支配地位。芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為高效分泌宿主主要用于重組酶分泌表達(dá)。酵母作為真核表達(dá)宿主可快速利用簡單碳源生長，蛋白表達(dá)水平高，同時其表達(dá)水平亦可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組成成分進(jìn)一步提高。部分重組酶可在絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)與分泌。雖然乳酸菌可作為食品安全型表達(dá)宿主用于食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域酶制劑表達(dá)，但該宿主機(jī)理研究并不完善仍需要進(jìn)一步研究。隨著技術(shù)不斷發(fā)展，微生物酶制劑應(yīng)用領(lǐng)域也將越來越廣。這對酶制劑表達(dá)與生產(chǎn)的需要亦是多層次的，主要包括酶高質(zhì)量、高品質(zhì)、高效催化等。然而，重組微生物酶的高效生產(chǎn)需要高通量表達(dá)技術(shù)的支持與協(xié)助。同時，在系統(tǒng)水平方面，需要蛋白組學(xué)方面的綜合覆蓋。因此，在將來發(fā)展過程中，只有將基因篩選和表達(dá)宿主構(gòu)建與工業(yè)發(fā)酵技術(shù)及后基因組技術(shù)相結(jié)合，才可能獲得重組酶高效表達(dá)系統(tǒng)。

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