利用Caco-2細胞模型評價乳源ACE抑制肽小腸吸收機制的研究進展

祝 倩，郭宇星,*，潘道東,2

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

近年來，隨著人們生活水平的提高，高血壓的發(fā)病率呈上升趨勢，全世界大約20%的人受此威脅。高血壓會引起患者心、腦、腎等器官損壞，并會引起糖脂代謝紊亂和糖尿病，嚴(yán)重時則會危及生命，因此，抗高血壓藥物的研究引起國內(nèi)外學(xué)者越來越多的重視[1]。

目前，治療高血壓的降壓藥物有多種，如利尿降壓劑、中樞神經(jīng)和交感神經(jīng)抑制劑、腎上腺素能受體組滯劑、酶抑制劑、鈣離子拮抗劑和血管擴張劑。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE，EC3.4.15.1)抑制劑大多是化學(xué)合成的，如卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、賴諾普利(Listinopril)等藥物。這類藥物作用時間短，停藥后血壓易反彈，而且人工合成藥物吸收排泄速度快，會引起咳嗽、味覺喪失、腎臟損傷及血管神經(jīng)性水腫等副作用[1]。如何通過非藥物療法達到治病、防病的目的，已為越來越多的人所接受。乳源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽是從乳蛋白水解物或發(fā)酵乳制品中提取的ACE抑制肽類物質(zhì)，作為天然的ACE抑制肽，無副作用，如果長期食用的話，可以起到緩解、防止高血壓的作用，當(dāng)前講究藥食同源，其越來越受到人們的廣泛關(guān)注。但是ACE抑制肽進入腸道后，由于腸道黏膜的低通透性、消化道酶系的降解作用等原因在一定程度上阻礙了肽的吸收[2]，造成了肽的生物利用度低下，所以研究ACE抑制肽在小腸中的吸收機制非常必要。

Caco-2細胞來源于人類結(jié)、直腸癌細胞，此細胞生物膜因在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)上與人小腸吸收細胞相似而廣泛用于腸道藥物、肽類等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收機制研究。本文概述乳源ACE抑制肽的研究進展，綜述利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽在小腸中的轉(zhuǎn)運機制的概況，旨在為肽類的營養(yǎng)吸收研究提供一定的參考。

1 ACE抑制肽研究進展及活性評價方法

1.1 ACE抑制肽研究進展

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅰ是一種羧二肽酶，普遍存在于哺乳動物組織中。它能使血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒苁湛s調(diào)節(jié)活性的血管緊張素Ⅱ；同時，它還能使緩激肽失去活性，轉(zhuǎn)變?yōu)闆]有活性的緩釋肽，從而使血管平滑肌收縮，使得血壓升高。ACE抑制肽是經(jīng)過蛋白質(zhì)分解酶的作用產(chǎn)生的一類具有能抑制ACE活性的多肽物質(zhì)，它通過抑制ACE的活性而起到降低血壓的作用[3]。

表1 酪蛋白多肽和乳清蛋白多肽的ACE抑制活性及其抗高血壓活性Table 1 ACE-inhibitory and antihypertensive activity of peptides derived from caseins and whey proteins

Ferreira[4]于1965年首次在南美茅頭蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中發(fā)現(xiàn)了ACE抑制肽之后，多種ACE抑制肽應(yīng)運而生。Oshima等[5]最早報道了由食品蛋白質(zhì)得到的ACE抑制肽，通過對明膠進行酶解獲得了活性較強的ACE抑制肽。近年來，人們發(fā)現(xiàn)了乳源ACE抑制肽，表1是已報導(dǎo)的乳源ACE抑制肽[6]。如Nakamura[7]、Yamamoto[8-9]等從發(fā)酵乳中提取出2種活性短肽——VPP和IPP，并證明其在體外的ACE抑制活性和降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓的能力。Lapointe等[10]從β-乳球蛋白酶解物中分離到β-Lg(142～148)，其氨基酸序列是Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg。Maruyama等[11]從牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分離出一種能抑制ACE活性的12肽。這些乳源ACE抑制肽對一些血壓正常的動物或人沒有降壓作用，具有安全性高、無毒副作用的特點[12]。

1.2 評價ACE抑制肽活性的方法

目前評價ACE抑制肽的方法主要為體內(nèi)法(動物實驗)和體外法。體內(nèi)法是以原發(fā)性高血壓大鼠為實驗對象，通過口服或靜脈注射不同劑量的ACE抑制劑，測定動脈收縮壓的大小，并與對照組進行比較。體外法主要采用兩種方法：一是可見光光度法，即將ACE作用的底物由帶有藍色的FAPGG代替含有馬尿酸的三肽，根據(jù)ACE作用后光吸收減弱的原理，通過減弱的程度來評價ACE抑制肽活性；二是色譜法，通過檢測產(chǎn)物中的馬尿酸含量來確定其是否具有ACE抑制活性[13]。

但嚴(yán)格來說，ACE抑制肽并不完全等同于降壓肽。降壓肽指的是經(jīng)過體內(nèi)或臨床實驗證明確實具有降血壓功能的肽段，而ACE抑制肽則是指體外檢測具有抑制ACE活性的小肽，并不能完全保證其在動物體內(nèi)能發(fā)揮降壓作用。實際上，有些肽的體外ACE抑制活性與體內(nèi)降壓效果不一致，可能會出現(xiàn)體外檢測抑制活性低的肽卻在體內(nèi)顯示出強抗高血壓作用，這些肽可能是被體內(nèi)消化酶水解后生成了強活性的肽而發(fā)揮了降血壓的作用[14]。如Miguel等[15]發(fā)現(xiàn)多肽經(jīng)胃蛋白酶、胰酶或者小腸刷狀緣膜肽酶水解后ACE抑制活性下降，但仍然有抗高血壓活性。然而，還有些肽在體外檢測中有較高的ACE抑制活性，但體內(nèi)檢測卻沒有抗高血壓活性，如Anusha等[16]發(fā)現(xiàn)太平洋鱈魚魚蛋白水解物經(jīng)過胃腸道消化后的ACE抑制活性沒有改變，利用Caco-2細胞作為小腸吸收模型進行魚蛋白水解物的小腸吸收實驗，發(fā)現(xiàn)魚蛋白水解物在經(jīng)過Caco-2細胞后沒有任何的ACE抑制活性，推測這種現(xiàn)象的原因可能是ACE抑制肽沒有被腸道吸收；ACE抑制肽被小腸刷狀緣膜上的肽酶水解后活性完全喪失。因此，研究ACE抑制肽由小腸上皮細胞轉(zhuǎn)運至血液的機制很有必要。

2 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽小腸吸收機制的進展

2.1 Caco-2細胞模型

Caco-2細胞系來源于人類結(jié)、直腸癌細胞，在普通的培養(yǎng)條件下就可以在有孔的多聚碳酸酯膜上自發(fā)的分化為腸上皮細胞單層，因此可以模擬體內(nèi)小腸上皮細胞層[17]。Caco-2細胞接種到碳酸聚酯多孔膜等基質(zhì)上，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下自發(fā)形成有極性的具微絨毛以及緊密連接等類似于小腸上皮細胞分化特征的單細胞層。因此，此細胞可以用來模擬小腸上皮細胞，廣泛用于營養(yǎng)物質(zhì)及藥物吸收過程中物理和生化屏障的研究。Per等[18]報道了利用Caco-2細胞模型預(yù)測不同藥物的跨腸上皮細胞膜的轉(zhuǎn)運途徑，并得出結(jié)論，Caco-2細胞模型可用于鑒定藥物吸收狀況。Kim等[19]通過對比Caco-2細胞體外細胞培養(yǎng)模型和小鼠原位灌注回腸模型研究了肽的吸收特性，觀察到Caco-2細胞體外細胞培養(yǎng)模型和小鼠原位灌注模型的實驗結(jié)果有很好的相關(guān)性，表明Caco-2細胞模型是研究多肽跨小腸細胞膜轉(zhuǎn)運很好的實驗系統(tǒng)。

2.2 乳源ACE抑制肽小腸吸收機制的研究進展

2.2.1 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽小腸攝入機制

2.2.1.1 營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)小腸轉(zhuǎn)運途徑的類型

小腸是機體內(nèi)吸收物質(zhì)的主要部位，物質(zhì)主要在小腸絨毛上的吸收細胞上進行。小腸單層柱狀上皮細胞面向黏膜側(cè)的膜為頂側(cè)膜，也稱為刷狀緣膜，面向血液側(cè)的膜為側(cè)底膜，也稱基底膜。肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)位于小腸上皮細胞的刷狀緣膜，上皮細胞之間通過緊密連接、間隙連接以及橋粒等方式相互連接。營養(yǎng)物質(zhì)口服后可通過以下途徑從腸腔進入血液循環(huán)：1)通過細胞之間連接的轉(zhuǎn)運；2)被動的穿越細胞胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運；3)主動的載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運及藥物外流；4)胞飲路徑，如圖1[20]所示。

圖 1 小腸上皮細胞轉(zhuǎn)運途徑示意圖[20]Fig.1 Schematic diagram of transportation in intestinal epithelial cells[20]

不同營養(yǎng)物質(zhì)進入小腸有不同途徑，主要和營養(yǎng)物質(zhì)的類型、結(jié)構(gòu)、親水性等有關(guān)，利用Caco-2細胞模型可以研究不同營養(yǎng)物質(zhì)的攝入途徑。如Caco-2細胞模型可用于載體介導(dǎo)主動轉(zhuǎn)運的研究，Caco-2細胞有3種主動轉(zhuǎn)運載體包括二肽載體、P-糖蛋白和寡肽載體。這些載體主要轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、葡萄糖、膽酸等)及與營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似的化合物。但對于脂溶性較好的營養(yǎng)物質(zhì)，油水分布系數(shù)大，易分布于上皮細胞脂質(zhì)膜，有報道[21]是通過被動轉(zhuǎn)運的。

2.2.1.2 乳源ACE抑制肽小腸轉(zhuǎn)運機制

乳源ACE抑制肽經(jīng)人體口服攝入后，必須要克服一系列障礙，以活性形式由小腸上皮細胞轉(zhuǎn)運至血液，進入人體體液循環(huán)，才能達到降低血壓的功效。目前，對于乳源ACE抑制肽在小腸中的轉(zhuǎn)運方式已有一些報道，已發(fā)現(xiàn)的乳源ACE抑制肽的轉(zhuǎn)運途徑有3種，即主動轉(zhuǎn)運、細胞旁路途徑轉(zhuǎn)運及胞飲作用轉(zhuǎn)運，多肽轉(zhuǎn)運途徑與多肽鏈長度有密切的關(guān)系。

有報道[22]認(rèn)為，二肽和三肽主要是通過人和哺乳動物小腸上皮細胞刷狀緣膜的寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepT1由主動轉(zhuǎn)運而吸收的。PepT1的成功克隆，揭示了哺乳動物的腸腔內(nèi)存在二肽和三肽的特殊轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，這種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可以介導(dǎo)二肽和三肽的吸收。然而，VPP是發(fā)現(xiàn)最早的乳源ACE抑制肽，Satake等[23]利用Caco-2細胞模型研究了其轉(zhuǎn)運過程，發(fā)現(xiàn)VPP雖然是三肽，但并不是通過刷狀緣膜的二肽和三肽轉(zhuǎn)運載體PepT1轉(zhuǎn)運至細胞中，而是通過細胞旁路途徑轉(zhuǎn)運的。因為肽轉(zhuǎn)運載體競爭性抑制劑Gly-Pro、奧代美寧A(Arphamenine A)和細胞內(nèi)吞抑制劑氧化苯胂對VPP的轉(zhuǎn)運沒有顯著的抑制作用，所以胞旁轉(zhuǎn)運是VPP轉(zhuǎn)運的主要機制。Tamura等[24]發(fā)現(xiàn)Val-Val-Val跨上皮的轉(zhuǎn)運途徑是通過旁路途徑的被動擴散。

對于大于三肽的寡肽，劉冬等[25]研究了降血壓肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)在Caco-2細胞模型中的吸收機制，確定VLPVP主要是通過細胞旁路轉(zhuǎn)運穿過小腸上皮細胞的。Pappenheimer等[26]已經(jīng)證明八肽很可能是通過旁路轉(zhuǎn)運吸收通過腸道上皮細胞。Adson等[27]得出結(jié)論，D-Phe-Gly主要是通過旁路轉(zhuǎn)運的。另外，疏水九肽的跨上皮轉(zhuǎn)運可能包括胞吞轉(zhuǎn)運作用，四肽的主要轉(zhuǎn)運途徑應(yīng)該是旁路途徑[28]。Quirós等[29]報導(dǎo)了來源于β-酪蛋白的ACE抑制肽LHLPLP的小腸轉(zhuǎn)運機制，LHLPLP在胞質(zhì)中被肽酶降解成HLPLP，再通過旁路途徑轉(zhuǎn)運出細胞。Cakir-Kiefer等[30]對五肽HLPLP的跨膜實驗表明，旁路被動擴散可能是其跨Caco-2細胞單層轉(zhuǎn)運的主要機制，同時還指出αs1-酪蛋白(αs1-CN 91～97)的小腸轉(zhuǎn)運途徑也可能是旁路擴散。β-酪蛋白(β-CN (193～209))，是一個有17個氨基酸殘基組成的疏水性、免疫調(diào)節(jié)活性長肽，Regazzo等[31]使用選擇性抑制劑來評估β-CN (193～209)轉(zhuǎn)運途徑，發(fā)現(xiàn)其是通過胞飲作用轉(zhuǎn)運的，但也不能排除通過緊密連接的旁路轉(zhuǎn)運。

從以上研究可發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)多肽在小腸中轉(zhuǎn)運是通過旁路轉(zhuǎn)運的被動擴散，被動擴散能否順利進行還與多肽所帶電荷、氫鍵鍵能、疏水性有關(guān)。Pauletti等[32]研究了肽的大小和帶電特性對跨Caco-2細胞膜旁路轉(zhuǎn)運時被動擴散的影響，發(fā)現(xiàn)肽帶正電荷會增強旁路跨膜的滲透性，但隨著肽鏈長度增加，凈電荷的影響就會減少。Robert等[33]發(fā)現(xiàn)肽被動吸收的一個重要的障礙是要打破水和肽之間的氫鍵，來溶解肽使之進入細胞膜。Chua等[34]觀察3種血管緊張素肽des-Asp-angiotensinⅠ(DAAⅠ)、Angiotensins Ⅲ和Angiotensins Ⅳ跨Caco-2細胞膜的特性，建立了結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運的相關(guān)性，得出DAAⅠ是通過被動擴散轉(zhuǎn)運的，而Angiotensins Ⅲ、Ⅳ是通過一種需能的、主動載體介質(zhì)轉(zhuǎn)運，在這3種肽中，DAAⅠ是最疏水的，有最高的氫鍵鍵能。

2.2.2 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽在小腸細胞中的滯留代謝

Caco-2細胞具有與小腸上皮細胞相同的細胞極性和緊密連接，存在于小腸細胞刷狀緣的酶，如氨肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶也同樣存在于Caco-2細胞中[35]。由于其含有各種代謝酶，因此更接近肽在人體內(nèi)吸收的實際環(huán)境，可用于肽在細胞中的滯留代謝研究。

乳源ACE抑制肽如果要以完整形式由小腸上皮細胞轉(zhuǎn)運至血液中，還必須抵御小腸腸道刷狀緣膜上的肽酶和胞質(zhì)肽酶的水解。目前研究發(fā)現(xiàn)，乳源ACE抑制肽能否被肽酶水解，與其肽鏈長度和氨基酸組成有關(guān)。經(jīng)報道[36]，刷狀緣膜上的肽酶能夠?qū)⒐央乃獬砂被?、二肽或三肽。對于四肽或以上的肽在刷狀緣膜超過90%被水解，三肽10%～60%，而二肽是10%。如Quirós等[29]報導(dǎo)了來源于β-酪蛋白的ACE抑制肽LHLPLP的小腸轉(zhuǎn)運機制，LHLPLP在胞質(zhì)中被肽酶降解成HLPLP。但 Vermeirssen等[37]通過Caco-2細胞研究Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg轉(zhuǎn)運機制，是在投藥后10min內(nèi)發(fā)生吸收的，這個七肽是完整轉(zhuǎn)運的。β-酪蛋白(β-CN (193～209))是一個有17個氨基酸殘基組成的長肽，Regazzo等[31]研究發(fā)現(xiàn)β-CN(193～209)能抵制小腸刷狀緣膜肽酶的作用。據(jù)此推測，肽酶特異性水解不僅與肽鏈長度有關(guān)，與多肽的氨基酸組成也有一定關(guān)系，Satake等[23]報導(dǎo)X-Pro-Pro、X-Lys-Pro和X-Lys-Trp結(jié)構(gòu)的多肽可以抵御腸道內(nèi)肽酶的水解。Quirós等[38]發(fā)現(xiàn)LHLPLP和LVYPFPGPIPNSLPQNIPP同時具有體外ACE抑制活性和體內(nèi)的抗血壓能力。研究發(fā)現(xiàn)N末端倒數(shù)第2位為亮氨酸時可提高ACE抑制活性，C末端位置為精氨酸時可同時提高ACE抑制肽活性和體內(nèi)抗血壓能力。Zhu Xiaolin等[39]研究了Ala-Phe、Phe-Ile和Ile-Phe轉(zhuǎn)運后的ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)Ala-Phe和Ile-Phe吸收后仍具有ACE抑制活性，但是Phe-Ile吸收后沒有ACE抑制活性，Ile-Phe和其他二肽相比，穿透小腸膜能力最強。

2.2.3 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽的外排機制

以往研究肽的小腸吸收主要考慮從腸腔一側(cè)(AP側(cè)) 攝入。實際上，肽從腸道到達血液，包括AP側(cè)攝入和腸壁一側(cè)(BL側(cè))外排兩個過程。Caco-2細胞模型也可用于肽外排機制的研究，P-糖蛋白(P-GP)和多藥耐藥蛋白(MRP)是Caco-2細胞中2種主要的轉(zhuǎn)運蛋白。兩者均為能量依賴性膜蛋白，發(fā)揮外排泵作用，可將胞內(nèi)化合物逆濃度梯度運至胞外，這與體內(nèi)小腸上皮的外排系統(tǒng)一致。這些外排系統(tǒng)是造成低生物利用度的原因之一[40]。鄭慧娜等[41]采用Caco-2單層細胞模型體外模擬馬氏珠母貝高F值寡肽(PHFP)小腸吸收，得出PHFP溶液在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運存在外排泵的作用。劉冬等[25]研究了降血壓肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)的外排機制，通過加入P-GP、MRP抑制劑，觀察VLPVP轉(zhuǎn)運情況，說明VLPVP在吸收過程中的外排主要是MRP介導(dǎo)的。

3 結(jié) 語

Caco-2細胞模型是目前應(yīng)用較廣泛的體外吸收模型，Caco-2細胞模型的應(yīng)用將人們對肽的吸收、生物轉(zhuǎn)化和生物利用度等機制的認(rèn)識提高到了細胞分子水平。用Caco-2細胞模型可以研究乳源ACE抑制肽在小腸中的攝入，細胞中滯留代謝及外排過程。通過利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽在小腸中的轉(zhuǎn)運機制，可了解多肽結(jié)構(gòu)(氨基酸組成、肽鏈長度、極性)與多肽生物利用度的關(guān)系，據(jù)此改善乳源ACE抑制肽口服后生物學(xué)效應(yīng)低下的現(xiàn)象。

大多數(shù)乳源ACE抑制肽是親水性的，跨小腸膜轉(zhuǎn)運方式一般限制在旁路途徑，被限制在這一途徑的肽的生物利用度一般不高，增強多肽疏水性同時降低氫鍵鍵能的化學(xué)修飾是很有潛力的增加生物利用度的策略[42]。另外也可以對肽進行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，比如琥珀?；⒁阴；㈦一梢蕴岣咂渲苄訹43]，提高乳源ACE抑制肽的生物利用度。另外，還可以采用乳化、脂質(zhì)體、微膠囊等技術(shù)用可生物降解的聚合體材料將肽包埋，在吸收目標(biāo)區(qū)定點釋放出肽，保護肽免遭腸道酶系的降解；使用蛋白酶抑制劑和吸收增強劑，增強肽在小腸黏膜的通透性，得以提高生物學(xué)效應(yīng)[2]。因此，利用Caco-2細胞研究乳源ACE抑制肽在小腸中的轉(zhuǎn)運機制(包括攝入與外排)和在人體小腸中的代謝穩(wěn)定性有重大意義。

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