黑曲霉ZJUQH產(chǎn)α-半乳糖苷酶的固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

徐騰洋，方若思，董亞晨，陳啟和*

(浙江大學食品科學與營養(yǎng)系，浙江省食品微生物技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310058)

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22) 屬外切糖苷酶類，特異性水解半乳糖類寡糖和多聚半乳-(葡)甘露聚糖的非還原性末端α-1,6-半乳糖苷鍵。因此它能水解蜜二糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖，也能水解半乳甘露聚糖、糖復合物(如糖蛋白類和糖脂類)中的α-半乳糖苷鍵[1-2]。1895年Bau首次從管底酵母(bottom yeast)中分離出α-半乳糖苷酶，但是直到20世紀80年代，人們才開始對α-半乳糖苷酶進行大規(guī)模的深入研究。它來源于微生物、植物和動物，以單體、二聚體、三聚體或四聚體形式存在；尤以微生物的產(chǎn)量高，如如雙歧桿菌(Bifidobacterium)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)[3]等。同時，該酶在食品、醫(yī)藥、飼料工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應用。

固體發(fā)酵(solid-state fermentation，SSF)在食品酶的發(fā)酵生產(chǎn)中具有很大潛力，如生產(chǎn)成本低、能源消耗少[4-5]等，同時還可能使酶具有更優(yōu)良的作用性質(zhì)[6-7]。響應面法(response surface methodology，RSM)是利用合理的實驗設(shè)計并通過實驗得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次方程來擬合因素和響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝。該法已廣泛應用于產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化[8-9]。本實驗主要通過用響應面法優(yōu)化黑曲霉ZJUQH的固體發(fā)酵培養(yǎng)基來提高α-半乳糖苷酶酶活，以獲得高產(chǎn)α-半乳糖苷酶的合適固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成。

1 材料與方法

1.1 菌種

保藏于中國科學院微生物研究所的黑曲霉ZJUQH，保藏號為CGMCC No.6152。

1.2 試劑

麩皮 杭州市東南面粉廠；豆粕(質(zhì)量標準為一級) 南京蛋白廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2120PC型紫外-可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；Sartorius電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；冷凍高速離心機 美國Beckman公司；L500臺式低速大容量離心機 湖南湘儀有限公司；DCQF-1超聲復頻清洗器 上海東大超聲儀器有限公司；HYG-Ⅱa恒溫調(diào)速搖床 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；TH-3560滅菌鍋 臺灣造鑫企業(yè)有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，瓊脂15～20g，葡萄糖20g，水1000mL，pH值自然。馬鈴薯去皮，切成細絲加水煮沸0.5h，然后用紗布過濾，再加糖，然后邊攪拌邊加入瓊脂，完全融化后補足水至1000mL。121℃、30min 滅菌；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(250mL三角瓶)：麩皮2.8g、玉米棒粉2.2g、蛋白胨0.4g、KH2PO40.03g、Na2HPO4·12H2O 0.08g、NaC1 0.001g、MgSO4·7H2O 0.002g、CaC120.0005g，pH值(6～6.5)自然。

1.5 方法

1.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)及酶液制備

將菌株接種到配好的PDA斜面培養(yǎng)基上，放入28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后，用無菌水或生理鹽水從斜面上刮下孢子制成孢子懸浮液，按一定接種量(孢子數(shù)約107CFU/mL)接種于裝有5g固體培養(yǎng)基質(zhì)的250mL三角瓶中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。將發(fā)酵所得的固體發(fā)酵基質(zhì)用攪拌機攪拌均勻稱取1g左右樣品，加入到10mL的0.2mmol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中萃取酶液，在28℃水浴搖床上振蕩1h，經(jīng)過濾紙過濾后獲得得待測定的粗酶液。在測定酶活前，采用pH6.0檸檬酸鹽緩沖液稀釋一定倍數(shù)后待用。

1.5.2 α-半乳糖苷酶酶活力測定

取適量發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)轉(zhuǎn)速10000r/min離心10min或者將浸提液過濾，將上清液或者濾液適當稀釋后取0.1mL，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液0.1mL，10mmol/L對硝基苯α-D-半乳吡喃糖苷0.05mL，于30℃溫度水浴10min，然后加入1.0mL的0.25mol/L的Na2CO3溶液終止反應，在400nm波長處測定分光光度值[10-11]。

酶活力單位定義：在pH6.0、30℃條件下，每分鐘生成1μmol對-硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

1.6 試驗設(shè)計

1.6.1 部分因子試驗設(shè)計(fractional factorial design，F(xiàn)FD)

部分因子試驗可以確定培養(yǎng)基中哪幾種因素是最重要的，與全因子設(shè)計相比，它能大大減少實驗次數(shù)、快速地篩選到對響應變量影響最重要的因子，并且能估計因子的主效和部分交互作用，且根據(jù)實驗數(shù)據(jù)擬合的一次多項式能有效地確定最陡爬坡方向，由此接近最大響應區(qū)域。在本實驗體系中，選擇24-1部分重復因子設(shè)計，每一獨立變量在高(+)和低(－)兩個水平上進行試驗，不同因子的編碼值和對應的自然值的關(guān)系可以表述如下：

式中：xi為各因素的編碼值；Xi為各因素的實際值；X0為各因素實際值的中心值；ΔXi是截距。α-半乳糖苷酶酶活力作為因變量(Yi)。

1.6.2 中心組合設(shè)計(central composite design，CCD)

響應面設(shè)計方法(RSM)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學統(tǒng)計方法。其中，中心組合設(shè)計法(CCD)是比較常用的RSM法，適用于兩個因素的優(yōu)化實驗。用SAS package(SAS Institute, Cary, NC, USA)多項式回歸分析對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到描述響應量(應變量)和自變量關(guān)系的二次多項式。模型可描述為：

式中：y為預測響應值即α-半乳糖苷酶酶活力；b0為截距；bi、bii、bij為回歸方程的線性系數(shù)、二次項參數(shù)和交互參數(shù)；xi和xj是因素。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗處理進行3次重復，取其平均值進行分析。實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件Design Expert V8.0.6(Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分因子試驗結(jié)果

在前期試驗基礎(chǔ)上，為尋求影響黑曲霉ZJUQH固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最顯著因子，重點針對影響發(fā)酵產(chǎn)該酶的比較顯著因子即蛋白胨、Na2HPO4·12H2O、料液比和接種量進行系統(tǒng)優(yōu)化。本研究選用四因素兩水平部分因子試驗設(shè)計，各因子編碼值及水平見表1，試驗設(shè)計及其結(jié)果見表2。

表 1 部分因子試驗各因子編碼值及水平Table 1 Factors and coded values of fractional factorial design

表 2 部分因子試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of fractional factorial experiment

表 3 部分因子試驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance table (ANOVA) for selected factorial model

對部分因子試驗結(jié)果進行回歸分析，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9818，意味著實驗數(shù)據(jù)的回歸模型有效，模型的P＜0.01表明回歸模型中的因子為非常顯著因子，這說明蛋白胨和料液比對黑曲霉ZJUQH產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶有非常顯著的影響，而Na2HPO4·12H2O對產(chǎn)酶的影響不明顯。對所建立的模型進行方差分析，模型的顯著水平P值為0.0017，說明模型足夠擬合試驗數(shù)據(jù)。

對試驗數(shù)據(jù)平均值與中心點試驗數(shù)據(jù)平均值進行t檢驗。結(jié)果表明：在方差相等和方差不等的條件下，中心試驗點平均值和部分重復試驗平均值差異較小，說明試驗的最優(yōu)點在當前試驗設(shè)計范圍之內(nèi)，不需要進行爬坡試驗設(shè)計[12-13]。

2.2 中心組合試驗

根據(jù)部分因子試驗結(jié)果及統(tǒng)計分析，對蛋白胨添加量(A)和料液比(B)進行進一步優(yōu)化。以處理0的水平為中心水平進行響應面試驗設(shè)計，其中心組合試驗因子水平設(shè)計見表4，試驗結(jié)果見表5。

表 4 中心組合試驗各因子及其編碼值Table 4 Factors and coded values of central composite design

表 5 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of central composite experiment

表 6 中心組合試驗方差分析結(jié)果Table 6 ANOVA results from CCD

對中心組合試驗數(shù)據(jù)進行響應面回歸分析，可得如下二次多項式回歸方程：

Y=51.51 + 10.06A +13.41B + 2.7AB – 1.5A2+ 0.71B2

表6是中心組合試驗的方差分析結(jié)果，數(shù)據(jù)顯示模型的P值為0.0018，說明所建立的模型是顯著的，在考察范圍能較好的闡明固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的酶活變化。二次回歸方程表征的響應曲面圖如圖1所示。由響應曲面圖1可知，當編碼水平A=0.1和B=1時，即優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為(250mL)：麩皮2.8g、玉米棒粉2.2g、蛋白胨0.6g、KH2PO40.03g、Na2HPO4·12H2O 0.08g、NaC1 0.001g和MgSO4·7H2O 0.002g，料液比1：2.44，pH值自然，接種量為1.5mL/5g，發(fā)酵培養(yǎng)6d，α-半乳糖苷酶酶活力預測的最大值為76.89U/g。

圖 1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨(A)和料液比(B)對發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶影響的響應曲面圖Fig.1 Reponse surface plot showing α-galactosidase production against peptone (A) and the ratio of culture medium solid to water (B)

2.3 驗證實驗

通過部分因素試驗和中心組合試驗獲得的優(yōu)化條件，即在250mL錐形瓶的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：麩皮2.8g、玉米棒粉2.2g、蛋白胨0.6g、KH2PO40.03g、Na2HPO4·12H2O 0.08g、NaC1 0.001g和MgSO4·7H2O 0.002g，料液比1：2.44，pH值自然，接種量為1.5mL/5g，在此條件進行驗證試驗，得到優(yōu)化后α-半乳糖苷酶酶活力達到(77.21±2.01)U/g(n=3)，其驗證結(jié)果顯示該優(yōu)化結(jié)果比未優(yōu)化培養(yǎng)基(蛋白胨0.4g、Na2HPO4·12H2O 0.08g、料液比1：3、接種量1.5mL/5g，pH值自然)提高了57.41%，本研究較好的達到了優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)α-半乳糖苷酶目的。在酶制劑的微生物發(fā)酵代謝研究中，培養(yǎng)條件的優(yōu)化對代謝產(chǎn)物合成有著重要的作用。目前科學研究最常用的優(yōu)化策略是單次因子法，而響應面方法是統(tǒng)計技術(shù)的合稱，包括試驗設(shè)計、建模、因子效應評估以及尋求因子最佳操作條件[14-15]。通過本研究證明，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成中水分含量是調(diào)控產(chǎn)酶的關(guān)鍵因子。

3 結(jié) 論

采用響應面方法對黑曲霉ZJUQH固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，利用部分因子試驗確定蛋白胨添加量、Na2HPO4·12H2O、料液比和接種量對黑曲霉ZJUQH產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響顯著順序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要影響因子為蛋白胨添加量、料液比。針對蛋白胨添加量和料液比進行中心組合試驗優(yōu)化，建立了蛋白胨添加量和料液比與黑曲霉ZJUQH產(chǎn)α-半乳糖苷酶之間的數(shù)學模型，由響應面確定了黑曲霉ZJUQH固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成，最后經(jīng)驗證實驗進一步表明黑曲霉ZJUQH產(chǎn)α-半乳糖苷酶的酶活力達到了(77.21±2.01)U/g。

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