實時熒光PCR技術(shù)快速檢測食品中的牛源成分

范麗麗，李培，丁洪流，金萍，傅春玲，*

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇蘇州215128）

食品的質(zhì)量和安全一直是社會關(guān)注的焦點，隨著人們生活水平的提高，肉制品消費(fèi)已經(jīng)成為食品消費(fèi)的主流[1]，要確保廣大消費(fèi)者的切身利益，就要保證各種肉制品質(zhì)量可靠。目前利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費(fèi)者而牟取暴利的事件屢屢出現(xiàn)[2]，不僅擾亂市場秩序，還給消費(fèi)者的身心健康帶來許多負(fù)面影響。近年來，隨著肉制品食用量的增長，人們對肉品質(zhì)量提出了更高的要求。由于加工肉品成分復(fù)雜，摻雜物質(zhì)種類繁多，通常很難用一般的化學(xué)方法鑒別真?zhèn)蝃3-4]，故亟待一種快速準(zhǔn)確的方法來鑒別肉類摻假。改革開放以來，我國居民牛肉的消費(fèi)量持續(xù)增加[5]，它為人們提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對人的生長發(fā)育、提高機(jī)體的免疫力等都具有重要的作用；同時若牛肉食品中摻入相對廉價的豬肉，冒犯了具有伊斯蘭教等宗教信仰的消費(fèi)者，也不利于社會和諧安定。因此，建立快速鑒別牛肉方法具有十分重要的意義。本文旨在利用Taqman實時熒光PCR技術(shù)建立一種快速、準(zhǔn)確、可靠的定性牛源性成分的方法，以滿足當(dāng)前的相關(guān)食品摻假檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

各種含牛肉成分的市售加工食品，如清真腸、兒童牛肉酥、鹵牛肉和撒尿肉丸等，以及鮮牛、豬、羊、雞、鴨肉等通過形態(tài)鑒別 分別購自蘇州各大型超市；組織基因組DNA提取試劑盒 購自天根生化科技有限公司；無水乙醇 分析純；Taqman Universal PCR master mix 購自ABI。

表1 引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probe

5810型臺式高速冷凍離心機(jī)、生物分光光度計德國Eppendorf公司；7000型實時熒光PCR儀 美國ABI公司；DKB-1915型恒溫水浴槽 IO-RAD公司；渦旋振蕩器，研缽。

1.2 樣品均質(zhì)及基因組模板制備

采用研缽等實驗器具對純豬、牛、羊、雞和鴨烘干（105℃）后進(jìn)行均質(zhì)處理，作為特異性及靈敏性實驗中的標(biāo)準(zhǔn)純品，以及制作后期模擬混合樣使用，均質(zhì)過程不同肉類分開處理，防止不同動物源性污染。按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行，最終提取OD260/OD280比值均在1.6～2.0之間的動物組織DNA。

1.3 引物、探針的設(shè)計合成

根據(jù)Genbank所公布的牛線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因序列，利用primer express 2.0軟件，依據(jù)引物探針設(shè)計原則，設(shè)計牛特異性引物和探針，GeneBank Accession：HQ184045.1，擴(kuò)增目的片段長度為91bp。引物探針序列見表1。

1.4 實時熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

反應(yīng)體系的體積為25μL：Taqman PCR master mix；上、下游引物，熒光標(biāo)記探針，各1μL，終濃度皆為0.4μmol/L；模板DNA（0.001～50ng/μL）1μL；其余不足用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40個循環(huán)。

1.5 特異性實驗

以牛、豬、羊及雞、鴨等純?nèi)馓崛〉腄NA，濃度50ng/μL，各取1μL，分別進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，以驗證所設(shè)計牛引物、探針的特異性。

1.6 靈敏度實驗

取純牛肉提取DNA，用滅菌雙蒸水10倍倍比稀釋，濃度10～0.001ng/μL，取1μL為模板，各濃度3個平行，進(jìn)行實時熒光PCR，檢測所設(shè)計牛引物、探針的靈敏度，并經(jīng)實驗重復(fù)驗證。

1.7 模擬樣品中牛源性成分檢測

為進(jìn)一步檢測牛特異性引物探針體系，制備不同模擬混合樣品，其中A類模擬樣為牛、豬肉混合樣品，B類為牛、羊肉混合樣品，C類為牛、雞混合樣品，D類為牛、鴨肉混合樣品，E類為牛、豬、羊、雞及鴨五種純?nèi)饣旌暇鶆蚝蟮臉悠罚魅夥N在混合樣中依次所占的質(zhì)量百分比見表2。之后每個混合樣提取DNA模板，各3個平行進(jìn)行實時熒光PCR，以檢驗該引物探針體系用于模擬混合樣品的檢測限。

2 結(jié)果與分析

表2 模擬混合肉類樣品（w/w）Table 2 Samples of meat mixture（w/w）

2.1 引物有效性驗證

利用所設(shè)計的引物，對牛模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖1中為四個重復(fù)樣品，由圖1可以看出，皆擴(kuò)增出約91bp的DNA片段，與預(yù)期所設(shè)計目的片段長度相符。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products

2.2 特異性實驗

為防止肉類食品中復(fù)雜成分可能抑制PCR擴(kuò)增，將各種肉類DNA模板含量控制在50ng進(jìn)行特異性實驗[6]。如圖2所示，所設(shè)計牛的引物探針體系只針對牛源性模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，Ct值達(dá)到22，且重復(fù)性良好，對其他動物源性成分，豬、羊、雞、鴨等肉類DNA均不能擴(kuò)增，后者分別用豬、羊、雞、鴨的種特異性引物探針體系均可得到特異性擴(kuò)增，可排除因DNA提取質(zhì)量差或PCR抑制物所致假陰性結(jié)果（另文發(fā)表），證實該檢測體系具有很好的特異性。ZHANG Chun-Lai[7]以牛線粒體細(xì)胞色素基因作為靶基因設(shè)計的檢測牛DNA的普通PCR和實時熒光PCR的引物探針體系對豬、羊、火雞、雞等肉類樣品無交叉反應(yīng)，本文建立牛引物探針體系也顯示對豬、羊、雞、鴨肉類DNA無交叉擴(kuò)增，可以滿足市售肉類牛源性檢測特異性要求。

圖2 牛源性引物探針體系特異性檢測Fig.2 The specificity detections of bovine primer-probe system

2.3 靈敏度實驗

為了驗證該體系的靈敏度，將牛DNA模板10倍倍比稀釋，圖3中牛DNA模板濃度依次為10、1、0.1、0.01、0.001ng/μL，其Ct值范圍為18.12～32.18，且各濃度重復(fù)性好。其中濃度0.001ng/μL的模板亦獲得正常擴(kuò)增，可見該引物探針體系可檢測到1pg的牛DNA。

圖3 牛源性引物探針體系靈敏性檢測Fig.3 The sensitivity detections of bovine primer-probe system

2.4 模擬混合樣品中牛源性成分檢測

用所建立的牛源性特異引物探針體系，對五類模擬混合肉質(zhì)樣品（如表2）進(jìn)行檢測，所有含5%～0.5%的牛肉樣品均獲得成功擴(kuò)增，Ct值范圍為21.96～28.03，可知該檢測體系的檢測限可低至0.5%以下。因為目的DNA含量愈高，Ct值越小。擴(kuò)增結(jié)果如表4，四種類模擬混合樣品的擴(kuò)增結(jié)果皆呈現(xiàn)隨牛肉成分含量降低，Ct呈增高趨勢。

2.5 食品樣品中牛源成分檢測

為了進(jìn)一步驗證牛引物探針體系的準(zhǔn)確性和實際應(yīng)用能力，對購自市場的食品進(jìn)行檢測。各食品樣品主要成分分別為清真腸：牛肉、玉米淀粉、食用大豆蛋白、食品添加劑；兒童牛肉酥：牛肉酥、鹽、糖；鹵牛肉：牛肉、食品添加劑等；速凍撒尿牛丸：牛肉、豬肉及雞肉等。四類食品各做三個重復(fù)，擴(kuò)增結(jié)果如圖4，自左至右四組曲線依次為清真腸、牛肉酥、鹵牛肉和撒尿牛丸，皆獲得正常擴(kuò)增，表明該體系可檢測加工肉食品中所存在的牛肉成分。

表3 模擬混合肉樣中牛源性成分的檢測Table 3 Detections of bovine in meat mixtures

圖4 食品樣品牛源成分檢測Fig.4 Detections of bovine in food samples

3 討論

國內(nèi)已經(jīng)建立的食品肉種的檢測方法存在一些應(yīng)用方面的缺陷，如趙紅波等[8]所建立的紅外光譜技術(shù)以及田金輝等[9]的T-RFLP鑒定方法目前僅針對于生鮮肉，尚無法應(yīng)用于熟牛肉以及混合肉樣食品的檢測。而孫艷華等[10]建立的普通PCR檢測熟肉肉類來源的方法檢測限為5%，靈敏性不高，同時存在耗時長、產(chǎn)物易污染、不能批量檢測等問題[11]。Taqman實時熒光PCR技術(shù)在檢測食品種源方面具有優(yōu)勢：其特異性有引物和探針雙重保障，可避免假陽性；擴(kuò)增片段短（約100bp）不受高度加工食品DNA降解的影響；而且靈敏度高、定量準(zhǔn)確，可快速、自動化、批量檢測，特別適合于成分復(fù)雜的加工食品種源檢測。本文利用Taqman實時熒光PCR技術(shù)建立的牛源檢測體系通過針對牛線粒體細(xì)胞色素b基因保守序列設(shè)計引物和探針，可特異檢測牛源成分，而不受市售常見豬、羊、雞鴨等肉類種源的影響，檢測特異性較高；將陽性檢測限設(shè)定在CT設(shè)定在35循環(huán)以內(nèi)，也獲得了較高的靈敏性，可檢測1pg牛源DNA的存在；對于含5%～0.5%牛肉的不同類型模擬混合肉樣，均可準(zhǔn)確測定而不受其他種源肉的干擾。國外所利用實時熒光PCR方法進(jìn)行肉類種源鑒定的研究中，Jonker等[12]選取牛satellite IV一段序列設(shè)計引物探針，最低僅可檢測0.2ng牛DNA；Dooly等[6]同樣以線粒體細(xì)胞色素b基因為目的基因，其所建立的牛源檢測體系由于與其他肉種存在一定的交叉反應(yīng)，為滿足特異性需要，其CT限定在30循環(huán)以內(nèi)，如此便限制了該體系的靈敏度。Camma等[13]以cyt b基因作為目的基因建立的牛源引物探針體系可檢測0.8pg模板DNA，與本研究相近；但對于混合肉樣的檢測限僅達(dá)1%（CT值為27.78），高于本檢測體系的檢測限0.5%。因此相比國外已經(jīng)建立的方法，本文建立的牛源檢測體系在特異性、靈敏性上具有一定的優(yōu)勢。同時經(jīng)對市售樣品的應(yīng)用性檢測，可特異的檢測出各種加工食品，如火腿腸、肉丸中的牛源成分，驗證了該檢測體系應(yīng)用性較好。

本研究建立的食品中牛源性成分檢測體系經(jīng)驗證具有較好的特異性和高靈敏度，以及很好的市場檢測應(yīng)用能力，具有準(zhǔn)確、省時等特點，可作為市售食品中牛源成分檢測的有效手段。

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