近紅外光譜技術(shù)在酶法轉(zhuǎn)化制備L-鳥氨酸過程中的應(yīng)用

郭婷婷，肖 雪，丁國鈺，彭佳敏，* ，高智慧，白 鋼

(1.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津市分子藥學(xué)重點實驗室，天津300071;2.天津市啟仁醫(yī)藥科技有限公司，天津300457)

L-鳥氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，以游離的形式存在于組織和細(xì)胞中，具有重要的生理活性和功能［1］。L-鳥氨酸兼具有營養(yǎng)和治療功能，在醫(yī)療保?。?-3］、化工［4］等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前L-鳥氨酸主要有化學(xué)合成法［5］、水解精氨酸法［6］、微生物發(fā)酵法［7］等，由于化學(xué)合成法得到的是消旋體，分離較難，故現(xiàn)階段的研究主要集中在水解精氨酸法和微生物發(fā)酵法，因此對酶促反應(yīng)液及發(fā)酵液中L-鳥氨酸的含量測定有著相當(dāng)重要的意義。建立一種簡單、快速而又有效的檢測方法對于L-鳥氨酸的制備非常必要。目前，L-鳥氨酸的測定以采用HPLC 衍生化法［7］、氨基酸自動分析儀法［8］、氣相色譜［9］、離子交換色譜［10］、酶法分析［11］和比色法［12］為多，而HPLC 衍生化法和氣相色譜法操作復(fù)雜，氨基酸自動分析儀法費用昂貴，比色法操作較為麻煩，耗時較長。 近紅外光譜技術(shù) (Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是近年來迅速發(fā)展起來的一種高新分析技術(shù)，具有簡便、快速、低成本、無污染、對樣品無破壞性以及可實現(xiàn)多組分同時測定等優(yōu)點，是最適于實現(xiàn)在線分析和實時控制的成熟技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于釀酒［13］、制藥［14］、化工［15］、食品［16］等行業(yè)的質(zhì)量監(jiān)測、控制和相關(guān)研究。NIRS 在發(fā)酵過程檢測領(lǐng)域的研究已有文獻(xiàn)報道，早在1990 年，Cavinato 等人［17］采用光電二極管陣列光譜結(jié)合光纖探頭產(chǎn)生短波NIR 光譜監(jiān)測玻璃壁的發(fā)酵罐中乙醇含量;劉國海等［18］利用NIRS 結(jié)合ELM 快速檢測秸稈蛋白飼料固態(tài)發(fā)酵過程參數(shù)值pH。在氨基酸生產(chǎn)方面，Arnold 等人［19］成功的將NIR 技術(shù)應(yīng)用于CHO 細(xì)胞分批發(fā)酵過程中谷氨酰胺、氨基酸、乳酸和葡萄糖的含量測定，但其他相關(guān)報道較少。本文通過NIRS 分析法能夠快速測定絕大多數(shù)種類的化合物及其混合物，對酶法制備過程進(jìn)行迅速監(jiān)測，從而準(zhǔn)確快速確定L-鳥氨酸酶法制備的終點。利用NIRS 對酶促反應(yīng)主產(chǎn)物L(fēng)-鳥氨酸進(jìn)行測定，結(jié)合偏最小二乘法對其建立了定量模型，并進(jìn)行了初步的含量預(yù)測，為L-鳥氨酸酶法制備的在線控制提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

精氨酸酶 天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司(批號為20110919);L-精氨酸(純度＞99.0%) 阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司;茚三酮、冰乙酸、磷酸等 分析純，天津光復(fù)化學(xué)試劑研究所。

UV-1800 型紫外分光光度計 日本SHIMADZU公司;KQ3200 型超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司;HB-202 型恒溫金屬浴 上海民儀電子有限公司;Tensor 37 型近紅外光譜儀 德國Bruker 公司;Milli-Q 純化水系統(tǒng) 美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 L-鳥氨酸含量測定 L-鳥氨酸酶活測定及含量測定均采用茚三酮比色法［12］。

1.2.2 L-鳥氨酸酶法制備 利用精氨酸酶將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L-鳥氨酸，響應(yīng)面設(shè)計確定酶促反應(yīng)的最佳條件為:L-精氨酸150g/L，精氨酸酶0.5g/L，pH10，反應(yīng)溫度37℃。在最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)，收集0～12h 反應(yīng)樣品;將反應(yīng)體系擴大10 倍，在最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)并收集樣品。

1.2.3 近紅外光譜掃描 采集不同時間樣品的透射光譜圖，光譜掃描范圍4000～12000cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率為8cm-1，每個樣品重復(fù)掃描3 次，液體樣品池為2mm 光程的石英比色皿，實驗采用空氣為參比進(jìn)行光譜掃描，測量時溫度為25℃，濕度為50%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用了多種預(yù)處理方法如無光譜預(yù)處理(No spectral data preprocessing)、一階導(dǎo)數(shù)(Frist Derivation)、二階導(dǎo)數(shù)(Second Derivation)、矢量歸一化(Vector normalization，SNV)、多元散射校正(Multiplicative scattering correction，MSC )、Frist Derivation + SNV 和Frist Derivation + MSC 等對光譜進(jìn)行處理，并建立模型。建模樣品按照校正集∶預(yù)測集=4∶1 的比例劃分校正集與預(yù)測集，其中校正集的濃度范圍大于預(yù)測集。

采集的光譜數(shù)據(jù)，均運用OPUS 7.0 數(shù)據(jù)分析軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-鳥氨酸樣品的制備

2.1.1 精氨酸酶活力測定 通過酶活力測定最終得到L-鳥氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A =3.305c-0.0274，R2=0.9978，其中A 為吸光度，c 為L-鳥氨酸的濃度。精氨酸酶活力為6317U/g。

2.1.2 L-鳥氨酸樣品的制備 收集不同時間反應(yīng)樣品，采用茚三酮比色法測定L-鳥氨酸，并計算酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖1。

圖1 酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨時間變化趨勢圖Fig.1 The curve of enzymatic reaction conversion versus time

2.2 模型的建立與選擇

2.2.1 近紅外光譜采集及波長區(qū)間選擇 采集樣品的透射光譜，原始光譜見圖2。共收集97 份樣品，其中77 份用于建模，20 份用于外部檢驗。由圖2 可見，在5500～4000cm-1，儀器噪音較大，不適合建立模型，故選擇10000.0～5500.0cm-1波段建立模型。

圖2 樣本原始光譜圖Fig.2 The original near infrared transmitted spectra of the samples

2.2.2 預(yù)處理方法選擇 表1 為分別采用無光譜預(yù)處理、一階導(dǎo)數(shù)光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜、矢量歸一化光譜、多元散射校正、一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化和一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正等方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理后所建立模型的預(yù)測均方差(RMSEP)、校正均方差(RMSEE)和決定系數(shù)(R2)。由表1 可知，采用一階導(dǎo)數(shù)對光譜預(yù)處理時RMSEP 最小，R2值最大，RMSEE 較小，R2較大，效果最好。不同預(yù)處理方法得到的光譜圖如圖3 所示。

2.2.3 主因子數(shù)選擇 用偏最小二乘法建立校正模型，主成分?jǐn)?shù)的選擇對模型的預(yù)測能力影響較大。主成分?jǐn)?shù)太多，使模型包含過多的測量噪音;主成分?jǐn)?shù)過少，導(dǎo)致建模信息不全，預(yù)測能力差［20］。本研究采用檢驗集檢驗法，根據(jù)RMSEP 與RMSEE 隨主因子數(shù)變化圖(圖4)，選擇主因子數(shù)為4。

2.2.4 模型建立 綜上所述，本實驗在10000.0 ～5500.0cm-1波段范圍內(nèi)建立數(shù)學(xué)模型，最終選擇一階

圖3 不同預(yù)處理優(yōu)化后圖譜Fig.3 The spectra after the optimization of the different pretreatment

圖4 檢驗集檢驗均方差與主因子數(shù)相關(guān)圖Fig.4 Relationship of the rank and the RMSEP ＆ RMSEE of the test set validation

圖5 校正集樣品(A)與檢驗集樣品(B)的預(yù)測值與測定值的相關(guān)圖Fig.5 Correlation of NIR predicted and measured values for calibration set(A)and validation set(B)

2.3 模型的驗證及應(yīng)用

2.3.1 模型外部驗證 利用建立的定量模型，預(yù)測驗證集的20 個樣品，結(jié)果見圖6。由圖可見，20 個樣品近紅外光譜預(yù)測值與測定值的相關(guān)性良好，外部驗證模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9827，說明模型的預(yù)測效果較好。

2.3.2 模型的應(yīng)用 將建立的模型用于放大反應(yīng)體系后樣品的測定。由于反應(yīng)體系發(fā)生變化，需要對模型進(jìn)行校正。校正后模型參數(shù)如表3 所示。校正后模型與原模型相比較，模型的相關(guān)系數(shù)與均方差均略微降低，但仍可滿足測定要求。利用校正后的模型，預(yù)測放大反應(yīng)體系后的28 個樣品，結(jié)果見圖7。由圖可見，28 個樣品近紅外光譜預(yù)測值與測定值的相關(guān)性良好，模型預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2為0.9874，說明模型的預(yù)測效果較好。

3 結(jié)論

L-鳥氨酸是一種多功能的氨基酸，應(yīng)用越來越廣泛，有很強的開發(fā)價值，同時具有巨大的市場空間。與常規(guī)實驗方法相比，NIRS 樣品無需前處理，準(zhǔn)確性較高、費用低、耗時短、適用于生產(chǎn)過程在線監(jiān)測分析。本文利用NIRS 建立了L-鳥氨酸含量定量模型并驗證了模型能力，并將NIRS 應(yīng)用于模擬監(jiān)測L-鳥氨酸酶法制備過程中含量動態(tài)變化，結(jié)果證明:模型預(yù)測效果較好，可以用于L-鳥氨酸酶法制備實時監(jiān)測，同時也為L-鳥氨酸及其他氨基酸生產(chǎn)過程中的檢測提供一種新的研究思路。

表1 光譜預(yù)處理方法對分析模型的影響Table 1 Effect of different pretreatments on analysis model

表2 模型參數(shù)Table 2 Parameters of the model

表3 校正后模型參數(shù)Table 3 Parameters of the model after calibration

圖6 模型預(yù)測集相關(guān)圖Fig.6 Correlation of prediction values and measured values on the model

圖7 校正后模型驗證相關(guān)圖Fig.7 Correlation of prediction values and measured values on the model after calibration

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