基于免疫磁珠快速分離金黃色葡萄球菌的研究

王程程，趙 玲，李敏通，王蓉暉，李延斌，胡耀華，*

(1.西北農(nóng)林科技大學機械與電子工程學院，陜西楊凌712100;2.阿肯色大學生物與農(nóng)業(yè)工程系，美國阿肯色費耶特維爾72701)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是最常見的食物中毒病原菌之一，廣泛存在于自然界中，如空氣，水，人和動物的排泄物等，因此，食品很易受其污染［1-2］。金黃色葡萄球菌呈革蘭氏陽性，可分泌多種毒性蛋白質(zhì)，其分泌的金黃色葡萄球菌腸毒素可引起人類胃腸性多種疾?。?］。在美國，由其引起的食物中毒居第二位，占整個細菌性食物中毒的33%，在加拿大占45%［4］，我國每年此類中毒事件也屢有發(fā)生，金黃色葡萄球菌污染及其腸毒素已是世界性衛(wèi)生問題［5-6］。傳統(tǒng)檢測病原微生物的方法步驟較繁瑣，檢測周期長，在低濃度菌量下易出現(xiàn)漏檢，多數(shù)免疫學檢測所需成本高且耗時，對樣品要進行復雜的預處理［7］，難以滿足食品安全事件中快速準確的檢測需求。免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMBs)具有選擇性好，特異性強，能將目標菌從復雜的食品基質(zhì)中快速分離出來，起到快速分離、富集細菌的作用［8］。目前，國內(nèi)外已有學者利用免疫磁珠與其他檢測方法結(jié)合，如酶聯(lián)免疫法，PCR，量子點熒光檢測等對沙門氏菌［9-12］，大腸桿菌［13-14］，李斯特菌［15-17］，阪崎桿菌［18］等多種食源性微生物進行檢測研究，利用免疫磁珠對金黃色葡萄球菌的檢測尚處于探索階段［19］。本研究擬利用生物素化的金黃色葡萄球菌多抗包被鏈酶親和素磁珠制備免疫磁珠，對金黃色葡萄球菌免疫捕獲，結(jié)合傳統(tǒng)平板菌落計數(shù)，計算捕獲效率。通過實驗優(yōu)化建立基于免疫磁分離技術對金黃色葡萄球菌的快速分離方法，并利用該方法捕獲人工污染該菌的羊肉卷洗水樣品，驗證該方法用于食品樣品的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC27660) 由上?；墼派锟萍加邢薰咎峁?福氏志賀氏菌(ATCC12022) 購于美國菌種保藏所;冷凍羊肉卷(內(nèi)蒙古草原興發(fā)) 購自楊凌好又多超市;鏈霉親和素磁珠(180nm，2mg/mL) 購于江陰美英特公司;生物素化兔抗金葡菌多克隆抗體(4～5mg/mL) 購于美國Thermo 公司;Baird-Parker 培養(yǎng)基基礎、亞碲酸鉀卵黃增菌劑、LB 肉湯、營養(yǎng)瓊脂 均購于北京陸橋;PBS 緩沖液 購于Sigma 公司;牛血清蛋白 購于沃爾森公司。

納米磁分離器MS0206 購于江陰美英特公司;智能恒溫恒濕箱HWS-250 購于海曙賽福儀器廠;漩渦混合器VORTEX-5、旋轉(zhuǎn)搖床QB-210 均購于其林貝爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫磁珠的制備

1.2.1.1 磁珠與多抗的偶聯(lián) 分別取1.0mL(即2mg)的鏈霉親和素磁珠5 份于離心管中，用1.0mL的PBS(0.01mol/L，pH 7.4，后面均相同)清洗三遍，棄去清洗液，向其中分別加入10、30、50、70、100μL的生物素化兔抗金黃色葡萄球菌多抗(4～5mg/mL)后，向其中分別依次加入PBS 緩沖液490、470、450、430、400μL(保證混合液體積在500μL，這樣可充分振蕩均勻)，室溫下(28℃左右)以15r/min 振蕩30min［15-16］。置于納米磁分離器(0.4T)中，磁分離1.5min 使磁珠充分吸附后，吸去試管中的液體，再加入1.0mL PBS 清洗三遍后，用1.0mL PBS 重新分散磁珠。

1.2.1.2 免疫磁珠的封閉 磁分離上述免疫磁珠，去除液相后，取1mL 1% BSA 的PBS 緩沖液加入各管中，封閉振蕩(15r/min)1h 后，磁分離用PBS 徹底清洗三次。加入1.0mL 的PBS 重新分散免疫磁珠，并標記為IMB-10、IMB-30、IMB-50、IMB-70、IMB-100，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫捕獲金黃色葡萄球菌條件優(yōu)化

1.2.2.1 多克隆抗體包被鏈霉親和素磁珠加入量的優(yōu)化選取 分別取IMB-10、IMB-30、IMB-50、IMB-70、IMB-100 各60μL，加入到1.5mL 離心管中，磁分離后，加入菌懸液500μL，同時作只加入500μL菌懸液的陽性對照，在室溫下以15r/min 振蕩孵育45min，置于納米磁分離器中，磁分離1.5min 使磁珠充分吸附后，吸出廢液收集，用PBS 清洗兩遍，收集洗液，廢液和洗液混合于1.5mL 離心管中，IMB-菌復合物重新分散在1.0mL PBS 中。將陽性對照，IMB-菌懸液，廢液按10 倍梯度稀釋至103或102CFU/mL，分別取100μL 在Baird-Parker 平板上鋪盤，平行三次鋪盤。參考GB 4789.10-2010 將涂布好的平板在37℃培養(yǎng)45～48h 后計數(shù)。

計算捕獲效率:W(%)=Nb/N0×100

式中:W-免疫磁珠對金黃色葡萄球菌的捕獲效率(%);Nb-免疫磁珠捕獲到的金黃色葡萄球菌細菌數(shù)(CFU);N0-陽性對照中金黃色葡萄球菌細菌總數(shù)(CFU)。

1.2.2.2 免疫磁珠加入量的優(yōu)化選取 取免疫磁珠IMB-50，加入量分別為20、40、60、80、100μL 于5 個1.5mL 離心管中，具體操作同上，振蕩反應45min，磁分離后平板菌落計數(shù)，計算捕獲效率。

1.2.2.3 免疫捕獲時間的優(yōu)化選取 取4 份60μL 免疫磁珠IMB-50，具體操作同上，分別和菌懸液振蕩反應20、45、70、95min，磁分離后平板菌落計數(shù)，計算捕獲效率。

1.2.2.4 正交實驗設計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選用L9(34)正交表，以抗體加入量，免疫磁珠加入量，免疫捕獲時間為考察因素，進行4 因素3 水平(設一空列)的正交實驗，選取濃度為103CFU/mL 菌液進一步優(yōu)化免疫磁捕獲的條件。因素水平表如表1 所示。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The table of levels and factors to orthogonal test

1.2.3 免疫磁珠對不同濃度菌液的捕獲 將1mL 的金黃色葡萄球菌凍存液加入到9mL 滅菌LB 肉湯，混合均勻，37℃培養(yǎng)20h，用PBS 10 倍梯度稀釋，選取103、104、105、106CFU/mL 的菌懸液，按照正交實驗優(yōu)化的捕獲條件對以上濃度的菌懸液捕獲，參照方法1.2.2.1，重復3 次，計算捕獲效率，檢驗優(yōu)化出的捕獲條件是否可行。

1.2.4 靈敏度實驗 選取100、101、102CFU/mL 的菌懸液，在最佳免疫捕獲條件下，參照方法1.2.2.1 進行捕獲、磁分離。將陽性對照，IMB-菌懸液，廢液以0.3、0.3、0.4mL 分別在Baird-Parker 平板鋪盤，將涂布好的平板在37℃培養(yǎng)45～48h 后計數(shù)。

1.2.5 特異性實驗 將均含有103CFU/mL 的金黃色葡萄球菌和福氏志賀氏菌的混合液加入到免疫磁珠中，同時作陽性對照，在室溫下以15r/min 振蕩孵育45min，磁分離1.5min 后，用PBS 清洗兩遍，收集洗液，廢液和洗液混合于1.5mL 離心管中，IMB-菌復合物重新分散在1.0mL PBS 中。將陽性對照，IMB-菌懸液，廢液分別取100μL 同時在BP 平板和營養(yǎng)瓊脂平板上涂布，37℃培養(yǎng)45～48h 后觀察計數(shù)。

1.2.6 免疫磁分離食品樣品中金黃色葡萄球菌 準確稱取25g 冷凍羊肉卷，加入225mL 0.1%無菌PBS于三角瓶中，混合攪拌1min，收集洗水，各取9mL 洗水于無菌試管中，分別接入1mL 不同濃度的金黃色葡萄球菌懸液，選擇菌液濃度在102和103CFU/mL的樣品，同時作空白實驗，按上述方法免疫磁捕獲，BP 平板菌落計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫捕獲金黃色葡萄球菌條件優(yōu)化

2.1.1 多克隆抗體包被鏈霉親和素磁珠加入量的優(yōu)化選取 如圖1 所示，當加入的抗體量在10～30μL時，隨著抗體加入量的增加捕獲效率增大，隨后，隨著抗體加入量增加捕獲效率反而逐漸下降，并趨于平緩。原因是過量抗體的加入會導致空間阻礙和競爭，即便有更多數(shù)量的抗體附著在磁珠上，其連接的穩(wěn)定程度遠不如適量抗體與磁珠的結(jié)合，在接下來的磁珠分離和洗脫步驟中，結(jié)合不太緊的抗體會與磁珠再分離，導致捕獲效率反而下降。可見添加的抗體量過多不僅不利于反應的進行，同時也造成抗體的浪費，故初選30μL 抗體加入量的免疫磁珠。

圖1 多抗包被鏈霉親和素磁珠加入量對金黃色葡萄球菌捕獲效率的影響Fig.1 The effect of addition amount of antibody coating the magnetic beads on capture efficiency of SA

2.1.2 免疫磁珠加入量的優(yōu)化選取 如圖2 所示，隨著免疫磁珠加入量增加，金黃色葡萄球菌捕獲效率逐漸增大，當免疫磁珠加入量達到80μL 時，捕獲效率達到相對最大，再繼續(xù)增加捕獲效率反而降低，可能是由于免疫磁珠過多后，細菌表面吸附的磁珠量增大，這樣在強磁場下分離時造成部分細菌損傷，從而造成捕獲效率有所下降，故初選用80μL 作為免疫磁珠的最佳加入量。

圖2 免疫磁珠加入量對金黃色葡萄球菌捕獲效率的影響Fig.2 The effect of addition amount of IMB on capture efficiency of SA

2.1.3 免疫捕獲時間的優(yōu)化選取 如圖3 所示，免疫捕獲時間在20 ～45min 時，捕獲效率隨時間延長增大，當捕獲時間為45min 時，免疫磁珠對金黃色葡萄球菌的捕獲效率相對最高，45～95min 之間捕獲效率緩慢下降并趨于平緩。原因是免疫捕獲時間過短，細菌與免疫磁珠結(jié)合不充分，造成免疫磁珠沒有充分捕獲到目標菌，或者細菌和磁珠結(jié)合的穩(wěn)定程度還不高，在后續(xù)的磁珠分離、洗脫步驟中再分離，因而捕獲效率較低，又由于整個反應過程始終是在振蕩條件下進行的，反應時間過長則可能使部分細菌與磁珠脫離，捕獲效率略有下降。因此，初選免疫捕獲時間為45min。

圖3 免疫捕獲時間對金黃色葡萄球菌捕獲效率的影響Fig.3 The effect of response time on capture efficiency of SA

2.1.4 免疫捕獲的正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選用L9(34)正交表，進行4 因素3 水平的正交實驗(設一列空列)，實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗極差分析結(jié)果Table 2 The results of range analysis to orthogonal test

從表2 可以看出，各因素的影響次序是A ＞C ＞B，即依次是抗體包被磁珠的加入量、免疫捕獲時間和免疫磁珠加入量，同時，各因素的極差值均大于空列的極差值，說明各因素在實驗范圍內(nèi)對實驗均有明顯影響。根據(jù)正交實驗結(jié)果，得出最佳的免疫磁捕獲條件為抗體包被磁珠加入量為30μL，免疫磁珠加入80μL，與菌液免疫捕獲時間為45min。

2.2 免疫磁珠對不同濃度菌液的捕獲

為了進一步驗證最佳條件，同時檢驗免疫磁珠捕獲效率的穩(wěn)定性，在最佳免疫捕獲條件下，對103、104、105、106CFU/mL 的菌液捕獲效率如表3 所示。結(jié)果顯示，免疫磁珠對103～106CFU/mL PBS 中的金黃色葡萄球菌捕獲效率在33.50%到40.17%之間，捕獲效率基本都高于正交表中的最優(yōu)組合，說明優(yōu)化出的條件可行。

同時，免疫磁珠對不同濃度菌液的捕獲效率相對比較穩(wěn)定，這為后期免疫磁珠分離技術和其他檢測方法相結(jié)合定量檢測，獲得線性關系的標準曲線提供了基礎。

表3 免疫磁珠對不同濃度金黃色葡萄球菌的捕獲Table 3 The capture of IMB to different concentration SA in PBS

2.3 靈敏度實驗

從表4 可以看出，這種免疫磁捕獲金黃色葡萄球菌的方法可以捕獲到101CFU/mL 濃度的菌液，表明該方法有較高的靈敏度。

表4 免疫磁珠捕獲的靈敏度實驗Table 4 The sensitivity of the capture of IMB

2.4 特異性實驗

從表3 樣品5 可以看出，金黃色葡萄球菌免疫磁珠對含有6.46 × 103CFU/mL 志賀氏菌，4.91 ×103CFU/mL 金黃色葡萄球菌的混合菌液捕獲效率為33.02% ±4.59%，這與純金黃色葡萄球菌菌液的捕獲效率(34.84% ±6.84%)相近，表明志賀氏菌不會干擾免疫磁珠對金黃色葡萄球菌的捕獲。

另外，從同時可以生長這兩種菌的營養(yǎng)瓊脂平板上觀察菌落形態(tài)，免疫磁珠捕獲的菌都為金黃色葡萄球菌，而志賀氏菌基本都留在了洗下的廢液中，表明金黃色葡萄球菌免疫磁珠的特異性良好。

2.5 免疫磁分離食品樣品中金黃色葡萄球菌

利用該方法對人工接入102、103CFU/mL 金黃色葡萄球菌的羊肉卷洗水樣品免疫分離，捕獲效率分別為19.35% ±3.38%和17.74% ±2.92%，空白樣品中基本沒有金黃色葡萄球菌，結(jié)果表明免疫磁珠可以對實際樣品中的金黃色葡萄球菌捕獲，但捕獲效率有所降低，可能是由于樣品中的一些蛋白質(zhì)和抗體存在非特異性吸附，干擾了抗體對目標菌抗原的捕獲。因此，需要進一步探索，如簡單的樣品預處理，來優(yōu)化免疫磁分離應用在食品樣品中目標菌的捕獲。

免疫磁技術對目標菌快速捕獲，捕獲靈敏度高，為捕獲后快速檢測提供依據(jù)。目前，傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法操作繁瑣，檢測時間較長，不能滿足快速檢測的要求，而一些檢測方法靈敏度較低，需進行增菌培養(yǎng)，如ELISA，乳膠凝集實驗等，因此，利用納米磁珠對食品中的檢測目標高效捕獲，再結(jié)合其他檢測方法對其高靈敏地快速定量檢測，是本研究的優(yōu)勢，也是最終目標。

3 結(jié)論

本研究利用生物素化的金黃色葡萄球菌多抗(4～5mg/mL)包被直徑180nm 的鏈霉親和素磁珠，制備免疫磁珠。通過實驗設計，對免疫磁捕獲過程中的若干影響因素進行了研究。

單因素和正交實驗結(jié)果表明:在實驗范圍內(nèi)，各因素影響金黃色葡萄球菌捕獲效率的主次順序為抗體包被磁珠加入量＞免疫捕獲時間＞免疫磁珠加入量，最佳捕獲條件為選用30μL 抗體加入量包被的磁珠，免疫磁珠加入80μL，免疫捕獲45min，在此條件下，對103～106CFU/mL 的金黃色葡萄球菌捕獲效率為33.50%～40.17%。同時，該方法具有良好的靈敏度和特異性，可初步用于食品樣品中對金黃色葡萄球菌的免疫捕獲和分離。

免疫磁捕獲技術能與多種檢測方法聯(lián)用，如量子點熒光免疫方法，實時熒光PCR 方法等，實現(xiàn)對目標菌快速、準確的實時檢測。本研究制備了金黃色葡萄球菌多抗免疫磁珠，快速、有效地對金黃色葡萄球菌捕獲分離，捕獲時間小于1h，為下一步實時檢測提供了依據(jù)。

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