響應(yīng)面法優(yōu)化內(nèi)部沸騰法提取三七多糖

溫?fù)碥?，蔣瓊鳳，郭 浪

(1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲412004;2.湖南科技學(xué)院，湖南永州425100)

三七(Radix Notoginseng)又稱田七，為五加科人參屬多年生草本植物，是一種名貴的中藥材，具有止血化瘀、消腫止痛等功效［1］。三七中主要含皂苷、多糖、黃酮類化合物、揮發(fā)油等成分。研究表明［2-6］，三七多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化和延緩衰老等多種功效。目前，多糖的提取方法主要有水提法、醇提法、酸堿提法、酶提法、微波輔助法等，前三種提取方法耗時(shí)長、雜質(zhì)多，酶提法成本高，而微波輔助則設(shè)備昂貴，影響了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。韋藤幼等報(bào)道［7］提出了采用內(nèi)部沸騰提取植物有效成分的方法，即先用少量低沸點(diǎn)溶劑(如乙醇)充分潤濕被提物料，然后迅速加入超過溶劑沸點(diǎn)溫度的提取液，使?jié)B透到物料內(nèi)部的低沸點(diǎn)溶劑發(fā)生汽化，產(chǎn)生內(nèi)部沸騰，形成對(duì)流，從而強(qiáng)化提取過程，提高提取效果。響應(yīng)曲面法是一種實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)方法，與正交等傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法相比，它具有高效經(jīng)濟(jì)、精準(zhǔn)度高、能研究多因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)［8］，已被廣泛應(yīng)用到生物工程、食品工程、化學(xué)工程等領(lǐng)域［9］。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化內(nèi)部沸騰法提取三七多糖工藝條件，旨在為進(jìn)一步開發(fā)和利用三七這一名貴藥用植物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三七 購于株洲市藥材市場(chǎng);葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、鎢酸鈉、酒石酸鉀鈉、NaOH、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、乙醇等 均為分析純。

DHG-9140A 型干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HH.SYH-Ni2-C 水浴鍋 北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;SB-5200 超聲波清洗器 上海新芝生物技術(shù)研究所;LDZ4-0.8A 離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;UV-9100紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;FW-200 型高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三七干粉的制備 將三七洗凈后，置于80℃烘箱中烘干后粉碎，過80 目篩，制成三七干粉，備用。

1.2.2 內(nèi)部沸騰法提取三七多糖 稱取1g 三七干粉加入適量的60%的乙醇，置于功率為200W 的超聲波清洗器中，保持15min，使乙醇充分潤濕物料。迅速加入一定量的高溫?zé)崴?，并置于與熱水相同溫度的水浴中提取一定時(shí)間后，抽濾，取一定量的濾液離心，取上清液測(cè)多糖含量。

1.2.3 三七多糖測(cè)定方法 采用文獻(xiàn)［10］中的DNS法測(cè)定。取葡萄糖于105℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取100mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100mL，配成1.0mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7 支試管，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，加蒸餾水補(bǔ)充至每管總體積為2mL，然后各加入1.5mL DNS 試劑，混勻并置于沸水中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5mL 蒸餾水，搖勻，測(cè)A540nm。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，A540nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1g 三七干粉，按1∶20(g/mL)加入60%乙醇，置于超聲波清洗器中，在溫度為60℃條件下提取30min，小心倒出上清液，重新添加60%乙醇，重復(fù)提取4 次，合并所有提取液，置于4000r/min 離心機(jī)中離心10min，取上清液適當(dāng)稀釋，按DNS 法測(cè)540nm 處吸光值(A)。以吸光值對(duì)應(yīng)的多糖量乘以稀釋倍數(shù)，除以樣品的質(zhì)量，即得到三七總多糖。各實(shí)驗(yàn)條件下提取的多糖量按如下公式計(jì)算:

式中:c 為被測(cè)液A 值所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中葡萄糖濃度(mg/mL);D 為稀釋倍數(shù);V 為樣品液總體積(mL);m 為投加的三七干粉質(zhì)量(g)，0.9 為葡萄糖與多糖的換算系數(shù)。

1.2.4 相對(duì)提取率的計(jì)算 Y(%)=［m提/m總］×100，式中:Y 為三七多糖相對(duì)提取率，m提為某次提次的三七多糖量;m總為按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得的三七多糖總量。

1.2.5 三七多糖提取條件優(yōu)化方法 單因素實(shí)驗(yàn)主要考察提取溫度，料液比，提取時(shí)間3 個(gè)因素，提取溫度選取75、80、85、90、95、100℃5 個(gè)水平，料液比選取1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24(g/mL)5 個(gè)水平，提取時(shí)間選取4、5、6、7、8min 5 個(gè)水平，按1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，確定各因素最佳水平;在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化，確定內(nèi)部沸騰法提取三七多糖的最佳條件。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用Minitab15.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及總多糖含量測(cè)定結(jié)果

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，由圖可知，在0～1.2mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與吸光值A(chǔ) 呈線性關(guān)系。按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得三七總多糖含量為85.8mg/g。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 提取溫度對(duì)三七多糖相對(duì)提取率的影響 提取溫度對(duì)三七多糖相對(duì)提取率的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)溫度低于85℃時(shí)，相對(duì)提取率隨溫度的升高而增加，超過85℃則下降。這是因?yàn)?0%乙醇在常壓下的沸點(diǎn)為81℃左右［11］，當(dāng)溫度低于此，物料內(nèi)部乙醇未產(chǎn)生沸騰，5min 內(nèi)提取不完全，故提取效果差;但當(dāng)溫度過高時(shí)，乙醇沸騰過快，有效提取時(shí)間減少，且三七具有溶脹性，溫度過高容易造成大分子通道阻斷，進(jìn)而影響提取率［12］，故最佳提取溫度為85℃。

圖2 提取溫度對(duì)三七多糖提取的影響Fig.2 Effect of temperature on RNP extraction

2.2.2 料液比對(duì)三七多糖相對(duì)提取率的影響 料液比對(duì)三七多糖相對(duì)提取率的影響結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果表明，三七多糖的相對(duì)提取率隨料液比的減少而增加，當(dāng)料液比為1 ∶20 時(shí)，相對(duì)提取率達(dá)到84.46%，繼續(xù)降低料液比提取率趨于穩(wěn)定。而低料液比會(huì)造成提取劑的浪費(fèi)和后續(xù)濃縮的困難。故最適料液比為1∶20。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)三七多糖相對(duì)提取率的影響 提取時(shí)間對(duì)三七多糖相對(duì)提取率的影響結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，采用內(nèi)部沸騰法提取速度很快，5min 內(nèi)基本能完成多糖的提取，相對(duì)于超聲輔助等提取方法，該法能大大縮短提取時(shí)間，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，提取時(shí)間選擇為5min。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定了提取溫度(X1)、料液比(X2)、提取時(shí)間(X3)的最佳水平，以各因素的最佳水平為中心(X =0)，運(yùn)用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，利用Minitab15.0 軟件設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3 水平共15 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中中心點(diǎn)重復(fù)3 次，用來計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差，所得結(jié)果如表1 所示。

圖3 料液比對(duì)三七多糖提取的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on RNP extraction

圖4 提取時(shí)間對(duì)三七多糖提取的影響Fig.4 Effect of time on RNP extraction

表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Box-Behnken design and experimental results

以三七多糖相對(duì)提取率為響應(yīng)值，以提取溫度(X1)、料液比(X2)、提取時(shí)間(X3)為自變量，用Minitab15.0 軟件對(duì)表1 所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到結(jié)果見表2、表3。結(jié)果表明，模型在α =0.05 水平上回歸顯著;失擬項(xiàng)p ＞0.1，失擬不顯著;其中，X1、X2、平方項(xiàng)以及X1X2項(xiàng)對(duì)三七多糖相對(duì)提取率有顯著影響，X3、X1X3項(xiàng)不顯著。得到回歸方程:三七多糖相對(duì)提取率Y(%)= 84.58 + 0.56X1+1.06X2- 0.83X12- 2.86X22- 1.44X32+ 1.76X1X2+0.57X2X3。決定系數(shù)R2為97.70%，說明模型擬合程度好。求解模型得到各因素最佳水平為:提取溫度X1= 89.4℃、料液比X2= 1 ∶19.1、提取時(shí)間X3=5.08min，模型預(yù)測(cè)結(jié)果為85.05%?？紤]到實(shí)際操作情況，將最佳條件修約為:提取溫度X1=89℃、料液比X2=1∶19、提取時(shí)間X3=5min。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證，3 次實(shí)驗(yàn)取平均值，結(jié)果為84.86%，說明該模型可以用來指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，有實(shí)用價(jià)值。

表2 模型的回歸分析Table 2 Regression analysis of model

根據(jù)回歸方程繪制的響應(yīng)面圖見圖5～圖7，響應(yīng)面可以直接反映各因子對(duì)響應(yīng)值影響的大小。

圖5 Y=f(X1，X2)響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 3D analysis chart of y=f(X1，X2)

從圖5 可知，提取溫度X1與料液比X2交互作用顯著，固定提取時(shí)間X3為0 水平時(shí)，當(dāng)提取溫度為88.3℃、料液比為1∶19.2 時(shí)，三七多糖相對(duì)提取率存在最大值，可達(dá)85.01%。

圖6 顯示，固定提取溫度X1為0 水平時(shí)，料液比X2與提取時(shí)間X3交互作用較顯著，當(dāng)料液比為1∶19.6時(shí)，提取時(shí)間在4～5.17min 范圍內(nèi)，三七多糖相對(duì)提取率呈明顯上升趨勢(shì)，在5.17～6min 內(nèi)呈下降趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為5.17min，料液比對(duì)響應(yīng)值的影響呈先升后降趨勢(shì)，在1 ∶19.6 時(shí)達(dá)到極大值，為84.69%。

圖7 顯示，固定料液比X2為0 水平時(shí)，提取溫度X1與提取時(shí)間X3交互作用不顯著，固定提取溫度不變時(shí)，提取時(shí)間在4～6min 范圍內(nèi)，三七多糖相對(duì)提取率呈先升后降之勢(shì)。而當(dāng)固定提取時(shí)間時(shí)，提取溫度在85～86.8℃內(nèi)，三七多糖相對(duì)提取率上升并達(dá)到最大值，為84.67%。

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of model

圖6 Y=f(X2，X3)響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 3D analysis chart and y=f(X2，X3)

圖7 Y=f(X1，X3)響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 3D analysis chart of y=f(X1，X3)

3 結(jié)論

本文采用單因素結(jié)合響應(yīng)曲面法對(duì)內(nèi)部沸騰法提取三七多糖的條件進(jìn)行了研究。選取了提取溫度，料液比，提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定了各因素最佳水平，在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，建立了關(guān)鍵影響三七多糖提取率的二次多項(xiàng)式，得到最佳提取條件為:提取溫度X1= 89℃、料液比X2= 1 ∶19、提取時(shí)間X3=5min，在此條件下，三七多糖相對(duì)提取率可達(dá)84.86%。

內(nèi)部沸騰法應(yīng)用于提取植物有效成分，具有速度快，提取率高的特點(diǎn)［13］。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)三七前處理階段采用超聲輔助，使三七干粉與乙醇在更短的時(shí)間內(nèi)充分潤濕和滲入，進(jìn)一步節(jié)約了提取時(shí)間，提高提取效果，本實(shí)驗(yàn)中三七多糖提取過程僅20min即可完成，并能達(dá)到較高的提取效果。因此，該法是一種安全、高效、簡便的植物有效成分提取方法。

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