青養(yǎng)蛋白抗氧化肽的制備及其胃腸道消化性的研究

顧 敏，趙謀明，王 茜，陳小楓，任嬌艷

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641)

青養(yǎng)是青蛙的一種，為沼水蛙屬(Hylarana)。青養(yǎng)蛋白營(yíng)養(yǎng)與林蛙相似，含有豐富的氨基酸，尤其是人體必需氨基酸種類齊全，含量高，屬低脂肪、低膽固醇的肉類［1］。我國(guó)共有青蛙180 余種［2］，人們較為熟悉的是林蛙、虎紋蛙等，而青養(yǎng)卻很少為人們所知。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)青蛙的研究，主要集中在皮膚活性肽的提取，鑒定，基因克隆表達(dá)等［3］，約有20%集中在青蛙大腦活性物質(zhì)等的研究［4］，而對(duì)青蛙肉的研究比較少，且多集中在產(chǎn)品方面。而在青蛙類產(chǎn)品中，林蛙油的研究比較多，但是對(duì)林蛙肉的研究卻不多，主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分的分析［5］，及酶解工藝優(yōu)化等［6］，研究的不夠深入，此外，未曾查閱到與青養(yǎng)蛋白相關(guān)的研究。通過酶法加工青養(yǎng)肉蛋白可以獲得具有特殊生理機(jī)能的短肽。近年來的研究表明，食物蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的一些短肽除營(yíng)養(yǎng)功能外，還具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能，如抗疲勞、降血壓、降膽固醇、免疫調(diào)節(jié)、增加骨密度等［7］。食物蛋白質(zhì)酶解制備活性短肽研究已成為食品科學(xué)界和醫(yī)藥學(xué)界的關(guān)注點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、風(fēng)味酶四種酶水解青養(yǎng)蛋白，探討各種酶對(duì)酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)利用率和水解度的影響，并研究各種酶水解產(chǎn)物的理化特性，包括氨基酸組成、分子量分布、DPPH·清除能力、ORAC 差異，篩選出制備青養(yǎng)抗氧化肽的最佳用酶，且在此基礎(chǔ)上研究了抗氧化肽的胃腸道消化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活青養(yǎng)(平均重56 ±3.1g，長(zhǎng)12 ±5cm) 購(gòu)于廣州黃沙水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，脂肪含量為1.13% ±0.04%，蛋白含量為16.91% ±0.44%，去皮去頭去內(nèi)臟洗凈后絞成肉糜，置于-20℃冰箱中冷凍，備用;木瓜蛋白酶(6 ×105U/g)、堿性蛋白酶(2000U/mL)、胰酶(1500U/mg)和風(fēng)味酶(2 × 105U/g) 購(gòu)于Novozymes(諾維信)公司;凝膠層析標(biāo)準(zhǔn)樣品:細(xì)胞色素C(12384u)，Approprinin(6512.42u、維生素B12(1355u)、谷胱甘肽(612.64u)和 Gly - Gly - Gly(189.17u) 均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。DPPH 自由基(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)、熒光素(FL)、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物Trolox、2，2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH) 均購(gòu)于Sigma 公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析化學(xué)純。

MM12 型絞肉機(jī) 廣東省韶關(guān)市食品機(jī)械廠;UV-754 分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;KDN-2C 型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;KDN-40 消化爐 上海新嘉電子有限公司;GL-21 M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;酶標(biāo)儀 光譜掃描多功能讀數(shù)儀 Thermo scientific(芬蘭);電子天平 Mettler Toledo 儀器(上海)有限公司;超純水系統(tǒng) 廣州潔圣膜技術(shù)有限公司;XW-80A 渦旋混合儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;PHS-3C精密pH 計(jì) 上海雷磁精密儀器廠;A300 全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)membraPure 公司;Amersham 蛋白質(zhì)分析純化系統(tǒng) 美國(guó)GE Healthcare 公司。

1.2 酶解工藝流程［8］

青蛙肉糜樣品:離子水(1∶1)→加酶(酶量0.15%，酶解4h)→滅酶(95℃，10min)→快速冷卻至室溫，低溫離心(6000r/min，20min)→取上清液→冷凍干燥［8］。

木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味酶的酶解溫度是55℃，胰酶的酶解溫度是37℃;木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶的酶解pH 為自然pH，堿性蛋白酶和胰酶的酶解pH 為8.0。

1.3 模擬胃腸消化道酶系對(duì)青養(yǎng)多肽抗氧化活性的影響

體外模擬胃腸消化道酶系的反應(yīng)參考Cinq-Mars 等人［9］的方法并有所改進(jìn)，整個(gè)模擬過程分兩步反應(yīng)進(jìn)行:

第一步，模擬胃消化道酶系的消化過程。青養(yǎng)多肽粉復(fù)溶于去離子水中配成3%(w/w)的溶液，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系的pH 至2.0。加入胃蛋白酶(加量為青養(yǎng)蛋白含量的4%)，適度攪拌，然后在搖床中37℃恒溫孵育2h。在此過程中，在0、0.5、1.0、1.5、2.0h分別取樣，置于沸水浴中滅酶10min，迅速冷卻，離心(6000r/min，15min)，冷凍干燥，以測(cè)定多肽經(jīng)胃蛋白酶消化后其抗氧化活性的變化。

第二步，模擬腸消化道酶系的消化過程。青養(yǎng)多肽經(jīng)過胃消化道酶系消化2h 后，用1.0mol/L 氫氧化鈉調(diào)pH 至7.5。然后加入胰酶(加量為青養(yǎng)蛋白含量的4%)，適度攪拌，然后在搖床中37℃恒溫孵育2h。在此過程中，分別在2.5、3.0、3.5、4.0h 處取樣，置于沸水浴中滅酶10min，快速冷卻，離心(6000r/min，15min)，冷凍干燥，以測(cè)定多肽經(jīng)腸消化道后其抗氧化活性的變化。

1.4 實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)利用率的測(cè)定 用凱氏定氮法［10］分別測(cè)定肉糜原料和酶解液中蛋白氮含量，并按下式計(jì)算:

1.4.2 水解度的測(cè)定［11］水解度的測(cè)定方法采用甲醛滴定法，并按下式計(jì)算:

式中，AN 為青養(yǎng)酶解液中游離氨基氮的含量，g/100g;AN0為青養(yǎng)肉糜液酶解前游離氨基氮的含量，g/100g;N 為青養(yǎng)原料中總蛋白氮的含量，g/100g。

1.4.3 肽分子量分布情況 標(biāo)準(zhǔn)肽樣品:Globin III(分子量為2512)、GlobinⅡ(分子量為6214)、Globin I(分子量為8519)、Globin I +III(分子量為10700)、Globin I + Ⅱ(分子量14404)、Globin(分子量為16949)，美國(guó)Amersham 公司。分離柱為Superdexpeptide 30/100GL，預(yù)裝柱(Vt= 24.0mL，Vo=8.0mL)，進(jìn)樣體積為100μL，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為214nm，最大壓力設(shè)為1.8MPa。洗脫液為0.25mol/LNaCl，pH7.2 磷酸緩沖液，洗脫流速為0.5mL/min，分子量與保留體積的關(guān)系為y =-0.0578x +4.6289，R2=0.99，y 為標(biāo)準(zhǔn)肽分子量的對(duì)數(shù)，x 為洗脫體積，mL。

1.4.4 氨基酸分析 用A300 全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行青養(yǎng)酶解物的氨基酸組成分析。樣品用6mol/L的鹽酸在110℃條件下消化24h，定容到50mL，取2mL 溶液揮干，接著用稀釋液溶解，溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，氨基酸的含量用g/100g 表示。

1.4.5 水解產(chǎn)物清除DPPH·的測(cè)定 將2mL DPPH·溶液(0.2mmol/L，溶于95%乙醇)置于試管中，加入2mL 酶解液，振蕩混勻，室溫暗室反應(yīng)30min 后，若出現(xiàn)沉淀，6000r/min 離心15min，取上清液在517nm處測(cè)其吸光值(Ai)，空白為2mL 95%乙醇加入2mL蒸餾水調(diào)零，對(duì)照為2mL DPPH·溶液加上2mL 蒸餾水在測(cè)定波長(zhǎng)下的吸光值(Ac)，酶解液在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光值為A［12］j。酶解液對(duì)DPPH·的清除能力用抑制率R 表示:R(%)=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100。

1.4.6 氧自由基吸收能力(ORAC)實(shí)驗(yàn) ORAC 測(cè)定方法，參照Blanca Hernndez-Ledesma［13］等人的方法，并作適當(dāng)修改。在96 孔熒光板各微孔中加入待測(cè)樣品20μL(將Trolox 用相應(yīng)的緩沖液適當(dāng)稀釋)，接著加入75mmol/L 磷酸鹽緩沖液和70nmol/L FL各20μL，并將微孔板置于酶標(biāo)儀中，在37℃下孵化15min 后，用多道移液器迅速在各孔中加入12mmol/L AAPH 140μL 啟動(dòng)反應(yīng)，在37℃以激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm，每2min 測(cè)定一次各微孔的熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間設(shè)在熒光衰減呈基線后為止，即設(shè)2h。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

除定量描述分析外，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，方差分析采用SPSS軟件(11.5 版本，SPSS 公司，美國(guó))中的One-Way ANOVA 進(jìn)行分析，p ＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。采用Origin8.0 作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶對(duì)蛋白質(zhì)利用率、水解度和抗氧化活性的影響

分別采用木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶、堿性蛋白酶和胰酶水解青養(yǎng)蛋白，四種酶的酶解條件相同，測(cè)定各水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率、水解度和抗氧化活性，結(jié)果見圖1～圖4。由圖1 可知，四種酶中木瓜蛋白酶酶解的水解度最高，風(fēng)味酶次之，胰酶最低，只有7.14%;圖2 可知，四種酶中木瓜蛋白酶水解的蛋白質(zhì)回收率最高，達(dá)到61.20%，堿性蛋白酶次之，胰酶最低;由圖3 可知，捕獲DPPH·的能力，胰酶水解物的能力最強(qiáng)，風(fēng)味酶次之，其IC50值為6.93mg/mL;由圖4 可見，木瓜蛋白酶酶解物的ORAC 值最高，達(dá)到801.69μmoL TE/mg，風(fēng)味酶次之，由于期望蛋白質(zhì)利用率和抗氧化活性都能達(dá)到較好的狀態(tài)，所以使用風(fēng)味酶和木瓜蛋白酶復(fù)配酶解，按1∶1 的比例添加，酶的使用量分別為0.1%，酶解溫度為55℃，酶解結(jié)果如圖1～圖4 中所示，青養(yǎng)蛋白的水解度提高到了18.93% ±0.12%，蛋白回收率相對(duì)風(fēng)味酶也有了較大的提高，DPPH·清除能力相對(duì)木瓜蛋白酶水解物提高了，ORAC 值相對(duì)風(fēng)味酶液提高了。

圖1 不同酶酶解青養(yǎng)蛋白水解度的比較Fig.1 Comparison of hydrolysis degree of different enzymes

圖2 不同酶酶解青養(yǎng)蛋白回收率的比較Fig.2 Comparison of protein recovery of different enzymes

2.2 最佳抗氧化水解物的氨基酸組成及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

圖3 不同酶的水解物捕獲DPPH·的能力比較Fig.3 Comparison of scavenging activity on DPPH·of different hydrolysates

圖4 不同酶的水解物的ORAC 值比較Fig.4 Comparison of ORAC value of different hydrolysates

青養(yǎng)蛋白抗氧化肽中必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)為45.06%，但是由于氨基酸的測(cè)定方式采用的是酸水解的模式，色氨酸被酸破壞無法測(cè)定，導(dǎo)致必需氨基酸的含量偏低，因此EAA/TAA 的比值應(yīng)高于45.06%;必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)為82.01%，同理，真實(shí)的比值應(yīng)高于82.01%，均超過了FAO/WHO 制定的蛋白質(zhì)評(píng)價(jià)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式，EAA/TAA 為40%，EAA/NEAA 為60%，說明青蛙蛋白抗氧化肽是人體補(bǔ)充必需氨基酸的優(yōu)質(zhì)多肽食品。同時(shí)，富含具有抗氧化活性的氨基酸，如，Met、Tyr、Phe、His、Lys、Arg、Pro 等［14］。

表1 青養(yǎng)蛋白木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶復(fù)配酶解產(chǎn)物氨基酸分析Table 1 Amino acid composition of frog protein hydrolysate using papain and Flavorzyme

2.4 酶解產(chǎn)物的分子量分布

木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶復(fù)配酶解青養(yǎng)蛋白產(chǎn)物的分子量分布如圖5 所示。圖5 表明，多肽組分分子量分布主要集中在3ku 以下，高達(dá)73%，分子量高于10ku 的含量為3%，可以看出酶解效果較好，小分子肽為主要成分。據(jù)Aleman 等人研究發(fā)現(xiàn)，小分子量的肽段具有更好的抗氧化活性［15-16］，可能是因?yàn)樾》肿与母子谂c自由基結(jié)合，從而中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在捕獲DPPH·方面，分子大小的影響更為顯著，主要是因?yàn)樽杂苫肿雍腥齻€(gè)苯環(huán)，活性中心位于三個(gè)苯環(huán)間隙中，若抗氧化物質(zhì)體積大，則無法靠近自由基的活性中心，從而無法阻斷自由基反應(yīng)。因此可以看出青養(yǎng)水解物有作為抗氧化食物的潛力。

圖5 青養(yǎng)蛋白酶解產(chǎn)物的分子量分布Fig.5 Peptide molecular weight distribution of frog protein hydrolysate

2.5 模擬胃腸消化道酶系對(duì)青養(yǎng)多肽抗氧化活性的影響

2.5.1 模擬胃腸消化過程中青養(yǎng)多肽清除DPPH·能力的變化 如圖6所示，消化0h 時(shí)青養(yǎng)多肽對(duì)DPPH·自由基的清除率為17.20% ±4.8%。經(jīng)過胃蛋白酶消化0.5h 后，其清除率提高到51.09% ±2.01%(提高了3 倍)，進(jìn)一步用胃蛋白酶進(jìn)行消化，清除DPPH·自由基的能力仍在進(jìn)一步的提升，但1.5h 后，清除率有所下降。在第2.0h 開始模擬腸道消化過程，青養(yǎng)多肽經(jīng)胰酶消化0.5h 后，清除DPPH·自由基顯著下降到19.13% ±0.25%(p ＜0.05);消化2.0h 后，青養(yǎng)多肽的清除DPPH·自由基能力為16.70% ±1.53%。由酶空白樣可以看出，酸堿處理的過程中，清除DPPH·自由基的能力變化不大，可能是因?yàn)樗岬膹?qiáng)度不夠，影響較小。因此，推斷消化樣品抗氧化能力的變化主要是由消化酶所引起的。因?yàn)樵谖傅鞍酌赶^程中，大分子肽鏈降解為小分子，更多的疏水性氨基酸殘基暴露在外［17］，使得多肽更容易接近并捕獲疏水性的DPPH·自由基。而胰酶消化過程中抗氧化能力的降低可能是因?yàn)樵谝让概c多肽進(jìn)一步作用，使得青養(yǎng)多肽進(jìn)一步被降解，生成更短的小肽和游離氨基酸，產(chǎn)物具有較強(qiáng)的親水性。青養(yǎng)多肽模擬消化產(chǎn)物極性的增加使得它捕獲脂溶性的DPPH·自由基變難［17］。因此，青養(yǎng)多肽的DPPH·自由基清除能力在胰酶消化階段顯著降低。

圖6 模擬胃腸消化中青養(yǎng)多肽清除DPPH·自由基能力的變化(6mg/mL)Fig.6 Changes in DPPH·radical scavenging activity of frog peptides during sequential in vitro digestion(6 mg/mL)

2.5.2 模擬胃腸消化過程中青養(yǎng)多肽ORAC 值的變化 如圖7 所示，消化0h 時(shí)，青養(yǎng)多肽的ORAC 值為(511.86 ± 16.30)μmoLTE/mg，經(jīng)胃蛋白酶消化0.5h 后，其捕獲氧自由基能力(ORAC)提高到(618.22 ± 17.52)μmoLTE/mg(提高了21%)(p ＜0.05)，胃蛋白酶繼續(xù)消化時(shí)ORAC 值開始顯著下降。1.5～4.0h 之間的消化，ORAC 值無顯著變化，基本維持在510μmoLTE/mg 左右(p ＞0.05)。酶空白樣的ORAC 值也維持在450 ～500μmoLTE/mg 之間，只在酸處理0.5～1.0h 之間，ORAC 值有一個(gè)顯著降低的過程(p ＜0.05)，此后的ORAC 值無顯著性差異(p ＞0.05)，可能是因?yàn)樗釅A的處理時(shí)間較短，且強(qiáng)度較小，所以對(duì)多肽的影響較小。因此推斷，消化樣品的ORAC 值在0～0.5h 之間的顯著變化，主要是由于胃蛋白酶對(duì)青養(yǎng)多肽的降解作用，使得更多的疏水性氨基酸殘基暴露在外［17］，產(chǎn)物更易于捕獲氧自由基。而消化0.5～1.5h 時(shí)，ORAC 值顯著下降(p ＜0.05)，可能是因?yàn)樵厩囵B(yǎng)多肽的分子量不大，再進(jìn)一步降解，產(chǎn)生的小肽捕獲氧自由基的能力不強(qiáng)。這與水解度與抗氧化活性非正相關(guān)的觀點(diǎn)相符合。

圖7 模擬胃腸消化中青養(yǎng)多肽ORAC 值的變化Fig.7 Changes in ORAC value of frog peptides during sequential in vitro digestion

3 結(jié)論與討論

3.1 木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶復(fù)配酶解，可以得到較優(yōu)的酶解產(chǎn)物。相對(duì)于單酶，一般復(fù)配酶解會(huì)提高水解度，因?yàn)椴煌拿该盖形稽c(diǎn)有差異。

3.2 復(fù)配酶酶解產(chǎn)物的氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，青養(yǎng)蛋白酶解物具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且抗氧化性氨基酸的含量也較高，因此青養(yǎng)蛋白水解物是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)豐富且抗氧化活性較好的食物。

3.3 復(fù)配酶解所得產(chǎn)物經(jīng)分子量分析發(fā)現(xiàn)，小分子占多數(shù)，由于小分子量的肽段具有較好的抗氧化潛能，且易于被人體直接吸收，表明產(chǎn)物可以作為較好的抗氧化劑。

3.4 模擬胃腸道消化過程中，青養(yǎng)多肽的抗氧化活性在0～2.0h 之間活性變化較大，尤其是在0.5～1.0h之間得到的產(chǎn)物，抗氧化活性提高的較多，這可能是胃蛋白酶作用于大分子多肽，適度降解提高了活性;2.5～4.0h 為胰酶消化得到的抗氧化肽的抗氧化活性均低于胃蛋白酶消化產(chǎn)物，且產(chǎn)物之間的活性無顯著性差異，表明胰酶對(duì)多肽的降解作用不強(qiáng)。對(duì)于消化過程中的機(jī)理，有待在分子水平上進(jìn)一步研究。

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