PCR 技術(shù)區(qū)分液體麥精和玉米糖漿

吳申懋，鄧志瑞，陳 沁

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200444)

液體麥精又稱(chēng)為麥芽提取物，它以大麥和麥芽淀粉為原料，經(jīng)過(guò)粉碎、酶解、提取、過(guò)濾、真空濃縮等步驟制取。麥精制作過(guò)程主要是利用麥芽中所含的酶，對(duì)大麥中的淀粉和蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，產(chǎn)生一系列的單糖、雙糖和多糖、小分子蛋白肽和氨基酸等物質(zhì)，所以麥精作為一種源自谷物的天然食品含有豐富的麥芽糖、果糖、葡萄糖、蛋白質(zhì)、小分子肽、人體必須的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分［1-2］，廣泛用作飲料、果凍、糖果、冰激凌和調(diào)味食品的甜味劑及啤酒的發(fā)酵生產(chǎn)中［3］。玉米糖漿是采用優(yōu)質(zhì)玉米淀粉，經(jīng)過(guò)磨漿，糖化，冷卻，過(guò)濾，熬煮后制得的以麥芽糖為主的糖漿。因?yàn)橛衩滋菨{產(chǎn)量大，價(jià)格相對(duì)麥精低廉許多，而且現(xiàn)在市場(chǎng)上的玉米糖漿多為果葡糖漿。一些不法商販為追求巨大的商業(yè)利益，將相對(duì)便宜玉米糖漿摻入麥精中，極大地?cái)_亂了市場(chǎng)秩序，侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益。目前學(xué)術(shù)界對(duì)于果葡糖漿的作用沒(méi)有定論，還處于激烈的討論過(guò)程。有些研究表明，大量的果糖攝入和代謝會(huì)造成胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素作用的敏感性下降，引發(fā)其他疾病［4-5］。玉米糖漿與麥精均含有各種糖類(lèi)，理化性質(zhì)在一定程度上較為相似，一些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)可溶性固形物、總糖、總酸等常規(guī)物質(zhì)的檢測(cè)很難區(qū)分兩者的區(qū)別，而一些新型的檢測(cè)技術(shù)如紅外光譜，淀粉酶活性測(cè)定，碳同位素測(cè)定等方法存在檢測(cè)步驟繁瑣、儀器昂貴、工作量大等缺點(diǎn)，而且其方法也有一定的應(yīng)用限制［6-7］。通過(guò)PCR 技術(shù)檢測(cè)兩種糖中的DNA 可以避免上述的問(wèn)題，而且較為快捷，準(zhǔn)確性較高。鑒于此，本文試圖建立區(qū)分液體麥精和玉米糖漿PCR 方法。以?xún)煞N糖漿中的DNA 為研究對(duì)象，采用PCR 技術(shù)有關(guān)結(jié)果，將為食品中液體麥精和玉米糖漿的直接檢測(cè)和區(qū)分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

液體麥精、玉米糖漿 上海金啤生物科技有限公司;陽(yáng)性對(duì)照的“花22”、“西引2 號(hào)”大麥種子 上海崇明種子公司;“中糯2 號(hào)”、“申糯2 號(hào)”玉米種子 上海瑞奇種子公司;Taq 酶(5U/μL) 寶生物工程(大連)有限公司;高純dNTP(2.5mmol/L)北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences and product sizes

S1000TM Thermal Cycler PCR 儀 美國(guó)Bio-Rad公司;ND - 1000 微量紫外分光光度計(jì)美國(guó)NanoDrop 公司;GIS-1000 凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 的提取

1.2.1.1 改良CTAB 法 參照Chen［8］，Moller［9］等的方法并稍作修改。TES 緩沖液:100mmol/L Tris(pH8.0)，10mmol/L EDTA，2% SDS，2% PVP。

a.取2g 樣品裝入離心管中，加8mL TES、15μLProteinaseK，55℃孵育1h，每15min 渦旋混勻;

b.加5mol/L NaCl 溶液調(diào)節(jié)鹽濃度至2mol/L，加500μL 10%CTAB，65℃水浴10min;12000r/min 離心10min，取上清液至離心管中。

c.加入等體積 Tris 飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，4℃，12000r/min 離心10min，取上清液至離心管中。加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，4℃，12000r/min 離心10min，取上清液至離心管中。

d.加0.25 倍體積無(wú)水乙醇，0.1 倍體積5mol/L 醋酸鉀，-20℃放置1h，4℃，12000r/min 離心10min，取上清。

e.加入0.75 倍體積的預(yù)冷異丙醇，-20℃放置30min;4℃，12000r/min 離心15min，棄異丙醇;

f.加700μL70% 乙醇，輕輕渦旋混勻，4℃，12000r/min 離心5min，棄乙醇;重復(fù)一次。

g.室溫晾干至無(wú)乙醇味，加100μL ddH2O 熔解，-20℃凍存待用。

1.2.1.2 SDS 法 參照朱振雷等［10］并稍作修改，SDS提取液:200mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1%β-巰基乙醇。

a.稱(chēng)取3g 左右的樣品置于50mL 的離心管中，向管中加入10mL 65℃預(yù)熱的SDS 提取液，65℃水浴30min。

b.加入等體積 Tris 飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，4℃，12000r/min 離心10min，取上清液至離心管中。加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，4℃，1000r/min 離心10min，取上清液至離心管中。

c.加入0.8 倍體積的異丙醇，-20℃放置10 ～20min，12000r/min 離心10min。

d.加1000μL，輕輕渦旋混勻，4℃，12000r/min 離心5min，棄乙醇。

e.室溫晾干，至無(wú)乙醇味，加100μL ddH2O 熔解，-20℃凍存待用。

1.2.1.3 試劑盒法 使用深加工食品試劑盒(天根生化科技北京有限公司)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考徐亞維［11］和閆永榮［12］等的研究，根據(jù)大麥B1 醇溶蛋白基因(X03103.1)和玉米淀粉分支酶基因(AF072725.1)序列設(shè)計(jì)引物，植物18S rRNA 通用引物參考文獻(xiàn)［13］設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3 18S rRNA 通用引物PCR 采用植物18S rRNA通用引物對(duì)提取的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，確定DNA 質(zhì)量。PCR 反應(yīng)總體系20μL，含2μL 10 × Buffer(Mg2+plus)，3.2μL dNTP(2.5mmol/L)，0.2μL Taq 酶(5U/μL)，2μL DNA 模板，1μL 引物(3μmol/L)，ddH2O 補(bǔ)齊至20μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min，反應(yīng)35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min;反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用GIS-1000 凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.2.4 退火溫度對(duì)PCR 的影響 PCR 反應(yīng)體系如1.2.3，根據(jù)合成Barley 引物和Corn 引物的TM 值±5℃設(shè)置退火溫度為55～65℃，進(jìn)行梯度溫度PCR。

1.2.5 PCR 反應(yīng)的引物特異性 PCR 反應(yīng)體系如1.2.3，分別用Barley 引物和Corn 引物擴(kuò)增玉米和大麥種子DNA，引物終濃度均為0.1μmol/L。

1.2.6 PCR 方法的重復(fù)性 PCR 反應(yīng)體系如1.2.3，用Barley 引物擴(kuò)增大麥種子DNA;Corn 引物擴(kuò)增玉米種子DNA，以上實(shí)驗(yàn)在S1000TM Thermal Cycler PCR 儀和Techne Touchgene Gradient PCR 儀上重復(fù)進(jìn)行。

1.2.7 PCR 方法的應(yīng)用 PCR 反應(yīng)體系如1.2.3，用Barley 引物擴(kuò)增大麥提取物DNA;Corn 引物擴(kuò)增玉米糖漿DNA，引物終濃度均為0.1μmol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體麥精和玉米糖漿DNA 提取

用改良CTAB 法，SDS 法，試劑盒法提取液體麥精和玉米糖漿DNA，結(jié)果見(jiàn)表2。OD260/OD280常用來(lái)評(píng)估核酸的質(zhì)量，純度高的DNA 其OD260/OD280一般在1.6～1.8 之間。由表2 可知，用改良CTAB 法提取的液體麥精DNA OD260/OD280在1.6 左右;玉米糖漿DNA OD260/OD280在1.90，說(shuō)明污染較少，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用改良CTAB 法提取的DNA 進(jìn)行。SDS 法提取液體麥精DNA 時(shí)未能徹底去除色素，吸光度測(cè)定誤差過(guò)大，故數(shù)據(jù)未給出。

表2 液體麥精與玉米糖漿DNA 提取Table 2 DNA extraction from liquid malt extract and corn syrup

2.2 18S rRNA 通用引物PCR

用18S rRNA 通用引物PCR 擴(kuò)增改良CTAB 法提取的DNA，電泳結(jié)果如圖1 所示，兩種DNA 均能擴(kuò)增出250bp 的目的條帶。結(jié)果表明改良CTAB 法提取的液體麥精和玉米糖漿基因組DNA 可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的PCR 擴(kuò)增。

圖1 18SrRNA 通用引物PCR 產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR products using 18S rRNA universal primer

2.3 PCR 檢測(cè)方法的建立

2.3.1 退火溫度對(duì)PCR 的影響 以大麥種子和玉米種子DNA 作為擴(kuò)增模板，溫度梯度PCR 確定合適的退火溫度。電泳結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，在55～61.4℃隨著退火溫度的升高，擴(kuò)增產(chǎn)物的非特異性條帶逐漸減少。在61.4～65℃條帶沒(méi)有明顯變化，考慮到溫度過(guò)高時(shí)擴(kuò)增效率下降，本實(shí)驗(yàn)選擇61.4℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的退火溫度。

2.3.2 引物的特異性 以大麥和玉米種子DNA 作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行特異性引物PCR，電泳結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，大麥引物擴(kuò)增玉米DNA 和玉米引物擴(kuò)增大麥DNA 均無(wú)法得到條帶，表明引物具有較好的特異性。

2.3.3 PCR 方法的重復(fù)性 為了驗(yàn)證上述PCR 方法的重復(fù)性和可靠性，分別在兩臺(tái)PCR 儀上進(jìn)行PCR，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的DNA條帶位置一致，且重現(xiàn)性好，說(shuō)明此方法具有較好的穩(wěn)定性。

圖2 退火溫度對(duì)PCR 擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of annealing temperature on PCR amplification

圖3 PCR 擴(kuò)增的特異性Fig.3 Primer specificity for PCR amplification

2.3.4 PCR 方法的應(yīng)用 以上述建立的方法對(duì)液體麥精和玉米糖漿DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可知，兩種樣品的PCR 擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致(分別是500、919bp)，說(shuō)明液體麥精和玉米糖漿的DNA 通過(guò)特異性引物PCR 可以區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖4 PCR 方法的重復(fù)性Fig.4 Repeatability of PCR method

圖5 PCR 方法的應(yīng)用Fig.5 Application of PCR method

3 結(jié)論與討論

DNA 提取的純度直接影響到PCR 結(jié)果，進(jìn)而影響檢測(cè)的可行性和準(zhǔn)確度。多糖、色素、鹽和酚類(lèi)物質(zhì)都會(huì)影響DNA 的質(zhì)量。在植物DNA 的提取過(guò)程中多糖的去除始終是一個(gè)難點(diǎn)，由于多糖的許多理化性質(zhì)與DNA 相似，因此使用酚氯仿抽提、選擇性沉淀等方法無(wú)法有效地分離多糖和核酸［14］。去除多糖有多種方法，但常用有兩種:一是在DNA 提取過(guò)程中以低濃度乙醇沉淀多糖;二是在沉淀DNA 時(shí)，加入高鹽溶液，使多糖不隨DNA 沉淀。Hammar［15］等認(rèn)為提高CTAB 緩沖液中的NaCl 濃度能有效去除多糖，因?yàn)楦邼舛鹊柠}離子增加了不帶電荷的多糖物質(zhì)離子間作用力，使非極性作用力減弱，多糖物質(zhì)的極性增加，溶解度也隨之上升了，使得多糖與核酸可有效地分離［16］。Su［17］等在提取褐藻的RNA 時(shí)在用異丙醇沉淀前加入0.25 倍體積的無(wú)水乙醇沉淀多糖。Bahloule［18］和Ainsworth［19］等在各自的實(shí)驗(yàn)中在上清液中加入0.3 倍體積5mol/L 的醋酸鉀以去除多糖。本實(shí)驗(yàn)參考了上述文獻(xiàn)對(duì)CTAB 法加以修改，將緩沖液的NaCl 濃度提高到2mol/L，并在異丙醇沉淀DNA 前加0.25 倍體積無(wú)水乙醇和0.1 倍體積5mol/L醋酸鉀去除多糖，取得到了較好的結(jié)果。相比SDS法和試劑盒法，改良CTAB 法所提取到的DNA 無(wú)論質(zhì)量和濃度都較高。因此改良CTAB 法比較適用于液體麥精等糖漿類(lèi)物質(zhì)DNA 的提取。

影響PCR 擴(kuò)增的因素很多，包括退火溫度，引物濃度，模版量，循環(huán)數(shù)等，退火溫度是其中最重要的因素之一，不恰當(dāng)?shù)耐嘶饻囟韧鶗?huì)導(dǎo)致PCR 結(jié)果呈假陰性或出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。非特異性擴(kuò)增是與目的片段長(zhǎng)度不符的DNA 條帶或大片彌散狀拖帶［20］。根據(jù)發(fā)生機(jī)制，非特異性擴(kuò)增可大致分為兩類(lèi):第一類(lèi)非特異性擴(kuò)增是由引物與模板的非特異性結(jié)合引起的，第二類(lèi)非特異性擴(kuò)增是由引物與引物之間連接引起的。提高退火溫度能降低引物與模板間的非特異性結(jié)合，也能抑制引物間的自連接，對(duì)兩類(lèi)非特異性擴(kuò)增均有減少的作用。但有時(shí)過(guò)高的退火溫度會(huì)影響引物與目的片段的匹配，從而降低PCR 反應(yīng)擴(kuò)增效率導(dǎo)致產(chǎn)物量下降甚至得不到產(chǎn)物［21］。本實(shí)驗(yàn)嘗試了55 ～65℃的退火溫度，結(jié)果表明在61.4℃時(shí)，可以得到較為清晰、分辨率較高的條帶。

影響PCR 擴(kuò)增的因素很多，包括退火溫度，引物濃度，模版量，循環(huán)數(shù)等，本文主要對(duì)其中最重要的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)玉米DNA 退火溫度范圍較寬，當(dāng)退火溫度在57℃以上時(shí)，PCR 產(chǎn)物條帶均為明亮的單一條帶;但大麥DNA 在55～59℃時(shí)非特異性擴(kuò)增較多，直至61.4℃時(shí)，條帶單一性較好。此外，當(dāng)退火溫度為65℃時(shí)，條帶強(qiáng)度明顯減弱。考慮到較高的退火溫度會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降，因此綜合考慮，選擇61.4℃作為本研究的退火溫度。

PCR 的特異性決定檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。而特異性主要體現(xiàn)在引物與模板DNA 專(zhuān)一性的結(jié)合上，理想的引物只和目的序列兩側(cè)的序列結(jié)合。韓建勛［22］等根據(jù)梨類(lèi)甜蛋白基因，設(shè)計(jì)梨特異性引物，鑒定果汁中的梨成分。楊冬燕［23］等根據(jù)大豆特異性Lectin 基因設(shè)計(jì)引物，成功鑒別出了食用植物油中的摻假。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)大麥B1 醇溶蛋白基因和玉米的淀粉分支酶基因設(shè)計(jì)特異性引物，用玉米和大麥種子的DNA 進(jìn)行了PCR 對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明引物特異性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

區(qū)分糖漿類(lèi)食品摻假的方法很多，Padovan［24］等利用碳同位素比值法測(cè)定商品蜂蜜的摻假，根據(jù)摻入的蔗糖溶液和高果糖漿來(lái)確定檢測(cè)限，但是當(dāng)摻入的糖漿低于10% 時(shí)會(huì)被認(rèn)定為合格范圍內(nèi)。Kerkvliet 等［25］利用顯微鏡法檢測(cè)蜂蜜中摻假的蔗糖、酸水解甘蔗糖漿或飼喂蜜蜂的糖，添加的蔗糖具有很多特征顆粒如來(lái)自甘蔗莖的蔗糖碎片(薄壁細(xì)胞、單細(xì)胞環(huán)和表皮細(xì)胞等)，該方法雖然簡(jiǎn)便，但是現(xiàn)代工業(yè)糖漿常通過(guò)過(guò)濾減少摻假蔗糖中的細(xì)胞碎片，給鏡檢法掃描蔗糖摻假帶來(lái)一定難度，只能作為蜂蜜摻假與否的輔助檢測(cè)手段。納文娟等［26］利用淀粉酶活性變化測(cè)定蜂蜜中添加的蔗糖和淀粉，原理是摻入的蔗糖和淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖時(shí)需要消耗淀粉酶，造成淀粉酶降低，缺點(diǎn)是單純依靠酶活性測(cè)定很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)手段直接檢測(cè)糖漿中的DNA，只需要20ng 的DNA 就可以進(jìn)行PCR，操作步驟簡(jiǎn)便，成本較低，流程較短，而且能有效避免檢測(cè)中常見(jiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。

本文建立了提取液體麥精，玉米糖漿DNA 的方法，并以特異性引物PCR 擴(kuò)增得到了較好的結(jié)果，能夠明顯區(qū)分液體麥精和玉米糖漿，為以分子生物學(xué)手段檢測(cè)液體麥精的摻假奠定了基礎(chǔ)。

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