劉曉翠,朱振元,孫會輕,李園園,代麗翠,張靜怡,呂 茜,高 輝
(食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院,天津300457)
古尼蟲草[Cordyceps gunnii(Berk.)Berk.]是寄生于蝙蝠蛾幼蟲的一種較大型蟲草[1],1983年我國首次報道了古尼蟲草[2]。實驗證明古尼蟲草與冬蟲夏草的95%乙醇浸液在紫外下光譜基本一致;蟲草與發(fā)酵所得的蟲草菌絲體具有相同的藥理作用[3-4],并且古尼蟲草菌絲體含有較多的蟲草多糖,因此繼冬蟲夏草之后,古尼蟲草逐漸成為另一種重要的蟲草資源[5-10]。蟲草多糖是蟲草中重要的活性物質(zhì),當前主要研究其提取純化方法、結(jié)構(gòu)、生物活性及作用機理[11-14]。李連德等[15]和許建明等[16]研究證明了古尼擬青霉小孢變種菌絲體胞內(nèi)多糖具有延緩果蠅成蟲的壽命作用,還可以減輕肝細胞壞死和肝臟炎癥。本實驗室在前期研究中,從古尼蟲草菌絲體中得到兩種分子量分別約為10ku和3700ku的單一成分多糖;體內(nèi)抗腫瘤活性研究表明,這兩種多糖均具有抗腫瘤作用,但大分子的蟲草多糖對腫瘤細胞的抑制率高于較小分子的蟲草多糖[17-20]。長期以來人們很重視通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高真菌菌絲生長,近年來國內(nèi)外的科技工作者開始初步涉及到發(fā)酵條件影響真菌多糖的形成。Chi-Hsein Chao等[21]研究了培養(yǎng)基的不同碳源和初始pH影響榆硬孔菌菌絲體多糖的理化性質(zhì);Chin-Hang Shu等[22]研究了pH條件影響牛樟菇菌絲體發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量和分子量。有關(guān)古尼蟲草的深層發(fā)酵的研究已有很多[23-24],但發(fā)酵條件對古尼蟲草多糖產(chǎn)量影響的研究還未見報道。因此,本文在前期研究的基礎(chǔ)上,主要對液體發(fā)酵過程中影響古尼蟲草多糖產(chǎn)量的營養(yǎng)條件進行優(yōu)化,屬于對現(xiàn)代資源與功能生物的研究,這對多糖產(chǎn)量及其利用率的提高具有顯著的意義。
古尼蟲草菌(Cordyceps gunnii) 取自于天津科技大學生物資源與功能食品實驗室保藏菌種;斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基 蔗糖2%,蛋白胨1%,KH2PO40.3%,MgSO4·7H2O 0.1%,pH均為自然,121℃滅菌20min;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖4%,蛋白胨1.5%,KH2PO40.05%,MgSO4·7H2O 0.1%,pH均為自然,121℃滅菌20min(注:以上各樣品濃度均為質(zhì)量濃度)。
GHX-9160B-1型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海?,攲嶒炘O(shè)備有限公司;LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器
上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;ESJ2054型電子分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司;TGL-16B型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;HJ6型多頭磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司;HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠;電熱鼓風干燥箱 余姚市遠東數(shù)控儀器廠;冷凍干燥機 美國Thermo。
1.2.1 菌種活化 取保存于4℃冷藏冰箱中PDA斜面上的古尼蟲草菌種,采用PDA試管斜面培養(yǎng)法進行活化,培養(yǎng)完成后,作為液體發(fā)酵種子液的母種供后續(xù)實驗使用。
1.2.2 種子液的培養(yǎng) 按配方配制種子培養(yǎng)液滅菌晾涼后,無菌操作臺中用接種針挑取0.25cm2的古尼蟲草斜面菌種到液體種子培養(yǎng)基中。置于170r/min的恒溫搖床中25℃培養(yǎng)3d。實驗中所有三角瓶的裝液量均為100mL/250mL。
1.2.3 碳源單因素實驗
1.2.3.1 碳源種類對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別加入4%的葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作為三種不同的碳源,其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。
按8%的接種量接種古尼蟲草的種子液后,置于170r/min的恒溫搖床中25℃培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結(jié)束后采集菌絲體,凍干,對其菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量進行測量,并求平均值。
1.2.3.2 碳源初始濃度對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響根據(jù)1.2.3.1實驗結(jié)果,選擇其中最好的一種作為碳源,進行初始濃度的影響實驗。按照基本培養(yǎng)基的要求,配制成碳源質(zhì)量濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的培養(yǎng)基,其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。接種量、培養(yǎng)條件及對菌絲體的處理同1.2.3.1。
1.2.4 氮源單因素實驗
1.2.4.1 氮源種類對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別加入1.0%的牛肉膏、酵母膏和蛋白胨作為三種不同的氮源,其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。接種量、培養(yǎng)條件及對菌絲體的處理同1.2.3.1。
1.2.4.2 氮源初始濃度對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響根據(jù)1.2.4.1的實驗結(jié)果,選擇則其中最好的一種作為氮源,進行初始濃度影響的實驗。按照基本培養(yǎng)基的要求,配制成氮源質(zhì)量濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的培養(yǎng)基,其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。接種量、培養(yǎng)條件及對菌絲體的處理同1.2.3.1。
1.2.5 正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,對影響古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的營養(yǎng)條件進行四因素三水平L9(34)正交實驗,各因素的實驗水平見表1。其中因素C、D是在本實驗室他人研究的基礎(chǔ)上確定的。
表1 正交設(shè)計因素水平表Table 1 Levels and factors table of orthogonal experiment
1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體的處理 恒溫搖床培養(yǎng)后,觀察菌絲體生長量和形態(tài)。將三角瓶中菌絲體和培養(yǎng)基一起分裝到50mL的離心管中,6000r/min離心10min后棄上清液,收集沉淀(即發(fā)酵所得的古尼蟲草菌絲體)。為避免培養(yǎng)基中多糖等成分對糖含量或干重的影響,再對所得沉淀進行抽濾處理,在抽濾過程中用蒸餾水沖洗沉淀3~4次,將菌體上附著的液體培養(yǎng)基沖洗干凈。所得沉淀冷凍干燥。
菌絲體生物量是本實驗測量指標之一,因此對凍干后的菌絲體稱重。菌絲體生物量的計算公式[25]見式(1):
式中,μ:菌絲體生物量(mg/100mL);m1:100mL培養(yǎng)基產(chǎn)出的干菌絲質(zhì)量(mg);V:培養(yǎng)液體積(100mL)。
1.2.7 古尼蟲草粗多糖的提取制備 取各配方所生產(chǎn)的蟲草菌絲粉,放入樣品瓶中,加入20倍的水,混勻,80℃沸水浴提取2h。布氏漏斗抽濾,取濾液,濾渣重復提取2次,合并濾液,濃縮后加4倍體積的95%乙醇4℃沉淀過夜;4000r/min離心8min后,收集沉淀,經(jīng)冷凍干燥得粗多糖。
采用苯酚-硫酸法測定粗多糖樣品中總糖的含量,采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定樣品中還原糖含量。多糖產(chǎn)量計算公式[26]見式(2)。
式中,μ′:多糖產(chǎn)量(mg/100mL);m2:100mL培養(yǎng)基產(chǎn)出的總粗多糖質(zhì)量(mg);m3:100mL培養(yǎng)基產(chǎn)出的還原糖質(zhì)量(mg);V′:培養(yǎng)液體積(100mL)。
1.2.8 多糖回收率實驗 選擇無水葡萄糖作為碳源,采用同一培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物,1、2兩組均稱取0.3g的古尼蟲草菌絲體粉末,2組樣品作為實驗組在定容時加入烘干至恒重的葡萄糖粉末31.0mg。用苯酚-硫酸法分別測量多糖含量后計算回收率,其公式[27]見式(3)。
式中,P為樣品加標回收率;m1為未加標試樣測定質(zhì)量(mg);m2為加標試樣測定質(zhì)量(mg);m0為加標質(zhì)量(mg)。
在微生物培養(yǎng)基中,最常用的碳源是葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉,其對古尼蟲草菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量影響的實驗結(jié)果如表2所示,當碳源為可溶性淀粉時,菌絲體生物量相對較高,但是在培養(yǎng)基配制過程中發(fā)現(xiàn),淀粉溶于培養(yǎng)基之后,培養(yǎng)基呈渾濁狀態(tài),且在搖床培養(yǎng)期間,三角瓶底部有一層白色沉淀,最后在對發(fā)酵液進行離心和抽濾處理時,也不能完全保證將沉淀洗凈,結(jié)果所得胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最低;當碳源為蔗糖時,菌絲體生物量相對較高,且胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達到184.08mg/100mL,因此選擇蔗糖作為碳源繼續(xù)進行碳源濃度實驗。
表2 碳源種類對古尼蟲草菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of Carbon source types on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii
不同蔗糖濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量影響的實驗結(jié)果見表3,當蔗糖質(zhì)量濃度為4%時,菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均達到最高,分別為1732.0、147.40mg/100mL,因此選擇蔗糖濃度為4%作為碳源濃度。
碳源單因素優(yōu)化實驗結(jié)果為:碳源種類為蔗糖,質(zhì)量濃度為4%。
表3 蔗糖濃度對古尼蟲草菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of sucrose concentration on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii
本實驗室前期研究中,采用了NaNO3和(NH4)2SO4作為氮源培養(yǎng)古尼蟲草,其產(chǎn)出的菌絲體生物量分別為:755.2、707.6mg/100mL,胞內(nèi)多糖產(chǎn)量分別為43.3、50.7mg/100mL,產(chǎn)量都不高,且為了與碳源種類數(shù)統(tǒng)一,本實驗選擇了三種常用有機氮源來進行氮源種類的篩選。實驗結(jié)果如表4所示,當?shù)鞍纂俗鳛榈磿r,菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量最高,分別為1357.7、98.87mg/100mL,因此選擇蛋白胨作為氮源繼續(xù)進行氮源濃度實驗。
表4 氮源種類對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of nitrogen source types on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii
不同蛋白胨濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量影響的實驗結(jié)果如表5所示,當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為1.0%時,菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均達到最高,分別為869.4、102.49mg/100mL,因此選擇蛋白胨濃度1.0%作為氮源濃度。
氮源單因素優(yōu)化實驗結(jié)果為:氮源種類為蛋白胨,質(zhì)量濃度為1.0%。
表5 蛋白胨濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 5 Effect of peptone concentration on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii
以多糖產(chǎn)量為指標,進行4因素3水平正交實驗,結(jié)果如表6所示。由極差R值大小可知,各因素作用主次為A>C>B>D,表明蔗糖濃度對胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響最大。根據(jù)K值比較,以A3B2C1D2組合為胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的最佳工藝條件,即蔗糖4%,蛋白胨1.0%,KH2PO40.05%,MgSO4·7H2O 0.1%。方差分析如表7所示,蔗糖濃度對胞內(nèi)多糖產(chǎn)量有顯著性的影響,因此在發(fā)酵條件優(yōu)化時要首先予以考慮。
表6 正交實驗結(jié)果Table 6 The results of orthogonal experiment
表7 方差分析表Table 7 Variance analysis of orthogonal test
為了確定最佳組合的效果,進行了驗證實驗,將正交實驗得到的最佳工藝組合A3B2C1D2與優(yōu)化前基礎(chǔ)培養(yǎng)基(蔗糖4%,蛋白胨1.5%,KH2PO40.05%,MgSO4·7H2O 0.1%)在相同條件下培養(yǎng),比較胞內(nèi)粗多糖產(chǎn)量的大小。設(shè)置三個平行實驗,熱水浸提多糖,重復三次,苯酚硫酸比色法測定多糖含量,計算胞內(nèi)多糖產(chǎn)量,結(jié)果如表8所示:
表8 驗證實驗結(jié)果Table 8 Validation test results of orthogonal design
從表8可以看出,當培養(yǎng)基配方為優(yōu)化培養(yǎng)基A3B2C1D2組合時,古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為(181.5±2.3)mg/100mL,而當培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時,古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為(141.4±2.4)mg/100mL,可得出,優(yōu)化后的培養(yǎng)基的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量提高了28.36%,優(yōu)化作用顯著(p<0.05)。故最佳工藝條件為:蔗糖4%,蛋白胨1.0%,KH2PO40.05%,MgSO4·7H2O 0.1%。
回收率實驗結(jié)果見表9?;厥章剩?9.39%。證明本實驗所用方法的系統(tǒng)誤差較小,適合本研究。由于菌絲體培養(yǎng)周期較長,本實驗只進行了一次回收率測定,理論上最少重復三次實驗。
表9 回收率實驗結(jié)果Table 9 The results of recovery test
本文通過單因素實驗和正交實驗,確定液體發(fā)酵古尼蟲草多糖的最佳工藝條件為蔗糖4%,蛋白胨1.0%,KH2PO40.05%,MgSO4·7H2O 0.1%。在此條件下,古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為(181.5±2.3)mg/100mL。庶糖濃度對發(fā)酵結(jié)果具有顯著性影響,在對發(fā)酵條件進行優(yōu)化時應(yīng)首先予以考慮?;厥章蕿?9.39%,證明本實驗所用方法的系統(tǒng)誤差較小,適合本研究。
此外,本研究中,在最佳單因素實驗條件下,古尼蟲草菌絲體生物量為869.4mg/100mL,胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為102.49mg/100mL,即多糖含量為117.89mg/g菌絲體,與孟祥賢[28]研究結(jié)果中多糖含量28.2mg/g及傅嵐研究結(jié)果中多糖含量41.92mg/g相比較,已有了很大程度的提高,可為大量獲得古尼蟲草多糖提供理論和技術(shù)指導。
通過對菌絲體生物量與多糖產(chǎn)量的對比發(fā)現(xiàn),兩者沒有相關(guān)性(除氮源種類組外),因此古尼蟲草菌絲體內(nèi)除了多糖外,還含有其他活性物質(zhì)。
本課題存在需進一步解決的問題,如對液體發(fā)酵古尼蟲草多糖過程中環(huán)境條件的優(yōu)化,有待于進一步研究。
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