富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及其功能性酸奶對SHR血壓的影響

王佳佳，胡志和，蔣 毅

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

心血管疾病以冠心病為主，冠心病又稱冠狀動脈硬化性心臟病，而高血壓是動脈粥樣硬化的重要危險因素[1]，且血壓水平與心血管發(fā)病危險呈正相關[2]。在WHO/ISH[3]、ESH/ESC[4]和中國高血壓治指南[5]中強調(diào)了控制收縮壓的重要性，闡述選擇降壓藥物的原則以及聯(lián)合用藥干預心血管危險因素的高血壓治療新觀念，但這些降壓藥物都有一定的毒副作用，如對心臟和腎造成損害或者對于特殊人群如心衰患者有使用限制[6]。人們逐漸發(fā)現(xiàn)食物蛋白質(zhì)水解后形成的小分子多肽具有明顯的降血壓作用，與普通降壓藥物相比具有無毒副作用、對正常的血壓沒有影響的特點。因此，食源性降血壓肽成為目前抗高血壓功能食品或藥物研究的重點之一[7]。目前，很多具有輔助降血壓功效的食物已被報道，如大豆[8]、牛奶[9]、乳酪[10]、魚肉、蔬菜、小麥、大米及苦蕎麩皮蛋白[11]等。

ACE抑制肽主要來自食品中的蛋白質(zhì)，目前已成功提取出的主要有乳類蛋白、植物類蛋白及動物類蛋白中的ACE抑制肽。酪蛋白富含磷、吸附鈣和豐富的必需氨基酸，酪蛋白的主要成分是αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白，重量比例是3∶0.8∶3∶1[12]。自Maruyama等[13]于1982年在酪蛋白水解物分離出具有ACE抑制活性的12肽（CEJ12），各國研究人員采用不同的方法從酪蛋白中分離提取了更多具有不同降壓效果的ACE抑制肽。

本文通過研究酪蛋白、酪蛋白雙酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）水解物、水解物的超濾產(chǎn)物、脫苦后的水解物和超濾物，分別以不同劑量灌胃SHR大鼠和正常Wistar大鼠，觀察其對大鼠血壓的影響。在此基礎上，用其最佳劑量制備功能性發(fā)酵乳，制備具有輔助降血壓作用的發(fā)酵乳制品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白 天津海河乳業(yè)有限公司；全脂乳粉 天津海河乳業(yè)有限公司；直投式發(fā)酵劑 CHR HANSEN；胰蛋白酶（10000U/g）、胃蛋白酶（10000U/g） Sigma公司；風味蛋白酶（33000U/g） 丹麥Novo公司；原發(fā)性SHR高血壓大鼠 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心；正常Wistar大鼠 北京維通利華實驗動物技術有限公司。

FA1104N電子天平 上海精密科學儀器有限公司；FLUKO FA-25均質(zhì)機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；PB-10 pH計 Sartorius德國賽多利斯股份公司；Scientz-50N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；BP-2006A智能無創(chuàng)血壓計 北京軟隆科技有限責任公司；6ku中空纖維膜組件 天津膜天膜工程技術有限公司。

1.2 酪蛋白的雙酶水解

根據(jù)張艷[14]所確定的胃蛋白酶和胰蛋白酶水解酪蛋白的條件，對酪蛋白進行水解。具體方法如下：

1.2.1 胃蛋白酶水解條件 水解條件為37℃，pH3.0，酶與底物質(zhì)量比為1∶100，底物質(zhì)量濃度7%。水解過程中滴加1mol/L HCl溶液維持pH3.0。水解3h后加熱滅酶結(jié)束反應。

1.2.2 胰蛋白酶水解條件 將胃蛋白酶水解后的酶解液pH調(diào)至7.7，并加熱至48℃，按照酶與底物質(zhì)量比1∶500加入酶液，繼續(xù)水解，水解過程中滴加1mol/L NaOH維持pH7.7。水解3h后加熱煮沸10min滅酶，然后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH7.0。4000r/min離心15min，取上清液進行冷凍干燥得到酪蛋白雙酶水解物的粉末。

1.3 風味酶法對水解物脫苦的單因素實驗

研究風味酶的酶底比（[E]/[S]）、pH、酶解時間對水解物脫苦效果的影響，固定[E]/[S]為3000U/g、pH6、酶解時間2h，其他變量因子水平見表1。以感官評定苦味值作為評價指標，評價方法如下：將通過風味酶水解的水解液提供給5名品嘗者，將酪蛋白雙酶水解液分別稀釋0、1、2、3、4、5、6、7、8倍，其對應的苦味評分分別是0、1、2、3、4、5、6、7、8。根據(jù)此評分標準，品嘗復合肽溶液的苦味，并與標準比較進行評分，最后取平均值表示苦味程度。

表1 風味酶法脫苦的單因素水平表Table 1 The factors and levels about single factor of debittering with flavourzyme

1.4 風味酶法對水解物脫苦的正交實驗

在單因素基礎上，按L9（33）正交表進行正交實驗，因素水平見表2。本實驗先通過感官評價初步確定因素水平的范圍，再利用電子舌技術通過對水解物苦味和苦味回味的評價選擇脫苦效果好的幾組，通過測定酪蛋白雙酶水解液及經(jīng)風味酶法脫苦處理的幾個典型試樣（這里苦味和苦味的回味數(shù)值越小，脫苦效果越好），選擇IC50值最小的條件。

表2 風味酶法正交實驗因素水平表Table 2 The factors and levels about orthogonal experiment of debittering with flavourzyme

1.4.1 ACE體外檢測及IC50的測定 因為風味蛋白酶對酪蛋白雙酶水解液的水解，可能會使水解液中原本的ACE抑制肽活性降低甚至喪失，所以需要從正交實驗中選取的最好的幾個結(jié)果中，挑選出對其活性影響最小的組合。

1.4.1.1 ACE抑制活性的體外檢測 采用最常用的HHL方法[15-16]體外檢測ACE抑制率。具體方法如表3所示。硼酸鈉緩沖液：含有300mmol/L NaCl 的100mmol/L硼酸鹽緩沖液（pH8.3），去離子水配制；HHL試劑：溶于硼酸鈉緩沖溶液，配成濃度為5mmol/L，分裝后-20℃保藏；ACE試劑：將0.25U的ACE用2.5mL的硼酸鈉緩沖溶液溶解，配成0.1U/mL，分裝后-20℃保藏；濃度1mol/L的鹽酸溶液；抑制劑：用硼酸鈉緩沖溶液溶解樣品成不同濃度。

表3 ACE抑制率體外檢測方法Table 3 The detection method of ACE inhibition ratio in vitro

根據(jù)表3，將各試劑加入到5mL離心管中混勻（每管做三組平行），反應結(jié)束后加入1.7mL乙酸乙酯，經(jīng)15s振蕩、混勻后離心（4000r/min，15min，4℃），吸取1.0mL乙酸乙酯層于試管中，在120℃的烘箱中烘干30min后，向試管中加入3mL去離子水，檢測在228nm處的吸光度，其計算公式為：

式中，A為反應中ACE抑制劑和ACE同時存在的吸光度；B為反應中不加抑制劑的吸光度，即對照；C為ACE和HHL空白反應的吸光度，即空白。

1.4.1.2 半數(shù)抑制濃度（IC50）的測定 稱取雙酶水解產(chǎn)物以及通過電子舌評定結(jié)果即脫苦效果好的幾種樣品，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.6、1.0mg/mL的溶液，測定各溶液的ACE抑制率，并繪制ACE抑制率曲線，計算出IC50值。

1.5 脫苦水解物的超濾

選取正交實驗最優(yōu)結(jié)果得到的水解物進行超濾，方法如下：利用截留分子量6ku的中空纖維膜組件對雙酶水解液進行循環(huán)超濾分離[17-19]，在室溫下，控制壓力0.05～0.10MPa，得到分子量小于6ku的溶液，并將其進行冷凍干燥成粉末。

1.6 功能性發(fā)酵乳的制備

將全脂乳粉（質(zhì)量濃度12g/100mL）、白砂糖（質(zhì)量濃度8g/100mL）、水分別加入降壓效果好的樣品制成功能性發(fā)酵乳，均質(zhì)20s后在90℃下滅菌5min，冷卻至42℃左右接種0.7‰的直投式發(fā)酵劑，42℃培養(yǎng)6.5h后，于4℃冰箱后熟15h冷藏備用。

1.7 動物實驗

1.7.1 實驗動物分組 12周齡雄性SHR大鼠40只，體質(zhì)量為（260±15）g，自由采食飲水，保持環(huán)境溫度（23±1）℃，相對濕度60%±5%，預飼養(yǎng)1周。大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，分別灌胃生理鹽水（10mL/kg mb）、低、中、高劑量的雙酶水解物及其脫苦產(chǎn)物（灌胃劑量為0.083、0.25、0.75g/kg mb），低、中、高劑量的雙酶水解物超濾物和脫苦產(chǎn)物的超濾物（灌胃劑量為0.01、0.03、0.09g/kg mb）。另取Wistar大鼠8只，分為2組，分別作為空白組和正常對照組，灌胃生理鹽水和高劑量水解產(chǎn)物。

采用同一批SHR大鼠進行實驗，間隔1周，待其血壓恢復原值后再進行灌胃其他產(chǎn)品的測試。

1.7.2 動物血壓測定 采用血壓計，測定大鼠尾動脈收縮壓（SBP）[20]。測定前，將大鼠固定于鼠網(wǎng)保溫套中在39℃恒溫預熱，使尾動脈擴張，血流暢通。按照1.7.1中劑量對相應組進行灌胃，每天灌胃1次，測定灌胃后1～8h的尾動脈血壓，連續(xù)測3次，取平均值。

1.7.3 單、多次灌胃水解物及其超濾物、脫苦水解物及其超濾物對大鼠SBP的影響

1.7.3.1 單次灌胃水解脫苦產(chǎn)物對大鼠SBP的影響按照1.7.1中劑量對相應組進行灌胃，每天1次，測定灌胃后1～8h的尾動脈血壓，連續(xù)測3次，觀察灌胃后SHR及Wistar大鼠的收縮壓（SBP）的變化。

1.7.3.2 連續(xù)灌胃水解脫苦產(chǎn)物對大鼠SBP的影響將各組以1.7.3.1中灌胃結(jié)果的最適劑量灌胃SHR大鼠，每隔4h灌胃1次，每天2次，測定灌胃后8h內(nèi)的SBP值。

1.7.3.4 單、多次灌胃功能性發(fā)酵乳對大鼠SBP的影響 單次灌胃發(fā)酵酸奶對SHR大鼠血壓的影響：按照1.7.3.1中單次灌胃后效果最好的劑量制備功能性發(fā)酵乳進行灌胃，每天1次，測定灌胃后1～8h的尾動脈血壓，連續(xù)測3次，觀察灌胃后大鼠的收縮壓（SBP）的變化。

連續(xù)灌胃發(fā)酵酸奶對SHR大鼠血壓的影響：以最佳劑量發(fā)酵酸奶灌胃SHR大鼠，每4h灌胃1次，每天2次，測定灌胃后8h內(nèi)的SBP值。

1.8 實驗數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件分析實驗結(jié)果，比較各組與對照組之間差異的顯著性，所得結(jié)果應用配對t檢驗，p＜0.05表明統(tǒng)計學有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 風味酶脫苦的單因素實驗結(jié)果

表4 風味酶法脫苦的單因素實驗感官評分結(jié)果Table 4 The restuls of sensory score about single factor of debittering with flavourzyme

由表4可以看出，隨著加酶量的增加苦味評分隨之增加，當[E]/[S]為3000U/g時水解液的苦味基本脫除，繼續(xù)增加酶量苦味消除效果不明顯；且通過觀察發(fā)現(xiàn)，隨著加入酶量的增加，水解液的顏色逐漸加深，不利于其進一步應用，故這里確定加酶量為3000U/g。在水解pH為6.5和水解時間2.0h時，苦味評分最好，故選擇水解pH為6.5、水解時間2.0h進行正交實驗。

2.2 風味酶法脫苦的正交實驗結(jié)果

由表6的方差分析可以看出，加酶量和pH對苦味的影響都為極顯著，時間對苦味值的影響為顯著，其中影響的主次因素為：pH＞加酶量＞水解時間。

由表7對苦味回味的方差分析可以看出，加酶量、pH、水解時間對苦味回味值的影響都極顯著，其中影響的主次因素為：pH＞加酶量＞水解時間。

2.3 風味酶法脫苦對ACE抑制活性的影響

由圖1結(jié)果顯示試樣3、6、8、9的IC50值分別是0.31、0.8、0.56和0.28mg/mL，與未經(jīng)脫苦的酪蛋白雙酶水解物的0.27mg/mL相比，試樣9不僅脫苦效果好，而且IC50值也是相對最低的，雖然風味酶法的脫苦仍略帶苦味，但配合加糖等辦法仍具有應用價值。

表5 風味酶法脫苦的正交實驗結(jié)果Table 5 The orthogonal experiment results about debittering with flavourzyme

表6 正交實驗結(jié)果（苦味值）方差分析表Table 6 Variance analysis for orthogonal array experimental results（bitterness value）

表7 正交實驗結(jié)果（苦味回味值）方差分析表Table 7 Variance analysis for orthogonal array experimental results（after-bitterness value）

圖1 風味酶法脫苦對IC50值的影響Fig.1 The effection for IC50 with flavor enzymatic

2.4 單次灌胃酪蛋白水解物對SHR和Wistar大鼠的影響

2.4.1 單次灌胃酪蛋白雙酶水解物對SHR和Wistar大鼠的影響 由圖2可知，灌胃酪蛋白雙酶水解物的所有劑量組SHR大鼠的血壓均與空白組相比較有明顯下降。統(tǒng)計顯示在8h內(nèi)各劑量組與空白組比較有顯著性差異（p＜0.05）。灌胃后，0～4h內(nèi)收縮壓（SBP）明顯降低，4h后SBP開始逐漸上升，8h恢復原值。低劑量組在5h時達到最大降壓值，下降了17.500mm Hg；中劑量組在4h時達到最大降壓值，下降了22.630mm Hg；高劑量組在4h時達到最大降壓值，下降了15.630mm Hg；然后血壓開始慢慢回升，而單次灌胃高劑量的酪蛋白與灌胃生理鹽水組相比對SHR的血壓沒有顯著的影響（p＞0.05）。高劑量組降壓效果反而差，分析原因可能是由于水解物由于是通過酸性和堿性環(huán)境水解而得來，故產(chǎn)生了大量的鹽類，由于高鹽會使得血壓有所升高。這表明經(jīng)雙酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）水解后的酪蛋白產(chǎn)生了可以降低血壓的ACE抑制肽。在8h基本恢復到灌胃前的水平，這表明酪蛋白雙酶水解物有較強的抗高血壓的效果。

圖2 單次灌胃酪蛋白雙酶水解物對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.2 Antihypertensive effect of single administration of casein bi-enzymatically hydrolysates on the SBP of SHR

對照正常鼠的血壓變化，由圖3可知，正常鼠灌胃高劑量的酪蛋白復合蛋白酶水解物后，在0～8h內(nèi)SBP無顯著變化，酪蛋白復合蛋白酶水解物組與空白對照組相比無顯著性差異（p＞0.05），結(jié)果表明灌胃酪蛋白雙酶水解產(chǎn)物對正常鼠的血壓變化沒有顯著影響。

圖3 單次灌胃酪蛋白雙酶水解物對Wistar大鼠血壓變化的影響Fig.3 Antihypertensive effect of single administration of casein bi-enzymatically hydrolysates on the SBP of Wistar

2.4.2 單次灌胃超濾物對SHR和Wistar大鼠的影響由圖4可知，SHR在灌胃不同劑量的超濾物后，0～4h內(nèi)收縮壓（SBP）有明顯降低，中劑量組在4h時達到最大降壓值，下降了33.375mm Hg；4h后SBP開始逐漸上升，8h恢復原值。統(tǒng)計檢驗結(jié)果顯示，低、中、高劑量組與對照組相比p＜0.05，因此三個劑量的灌胃組與對照組均有顯著性差異。

圖4 單次灌胃水解物的超濾物對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.4 Antihypertensive effect of single administration of ultrafiltration products about hydrolysates on the SBP of SHR

由圖5可知，正常鼠灌胃高劑量的超濾物后，在0～8h內(nèi)SBP無顯著變化。T檢驗結(jié)果也顯示，灌胃超濾物與空白對照組相比無顯著性差異（p＞0.05）。結(jié)果表明灌胃酪蛋白雙酶水解物的超濾產(chǎn)物對正常鼠的血壓變化沒有顯著影響。

圖5 單次灌胃水解物的超濾物對Wistar大鼠血壓變化的影響Fig.5 Antihypertensive effect of single administration of ultrafiltration products about hydrolysates on the SBP of Wistar

2.4.3 單次灌胃脫苦產(chǎn)物對SHR和Wistar大鼠的影響 由2.2和2.3可知，經(jīng)風味酶法脫苦的正交實驗中，試樣9不僅苦味值和苦味的回味值較低，而且而且IC50值與未經(jīng)脫苦的雙酶水解物相比也是最低的，因此這里選擇試樣9進行動物降壓實驗。

圖6 單次灌胃脫苦試樣9對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.6 Antihypertensive effect of single administration of debittering sample 9 on the SBP of SHR

由圖6可知，SHR在灌胃不同劑量的脫苦試樣9后，中、高劑量組在0～4h內(nèi)收縮壓（SBP）有明顯降低，并在4h時達到最大降壓值，下降了19.375mm Hg，4h后SBP開始逐漸上升，8h恢復原值，而低劑量組是在5h達到最低后逐漸上升的。統(tǒng)計結(jié)果顯示，低、中、高劑量組與對照組相比，p＜0.05，因此三個劑量的灌胃組與對照組均有顯著性差異。

圖7 單次灌胃脫苦試樣9對Wistar大鼠血壓變化的影響Fig.7 Antihypertensive effect of single administration of debittering sample 9 on the SBP of Wistar

由圖7可知，正常鼠灌胃高劑量的脫苦試樣9后，在0～8h內(nèi)SBP無顯著變化。T檢驗結(jié)果也顯示，灌胃高劑量的脫苦試樣9與空白對照組相比無顯著性差異（p＞0.05）。結(jié)果表明灌胃酪蛋白雙酶水解物的脫苦試樣9對正常鼠的血壓變化沒有顯著影響。

2.4.4 單次灌胃脫苦試樣9的超濾物對SHR和Wistar大鼠的影響 由圖8可知，SHR在灌胃不同劑量的脫苦試樣9的超濾物后，低、中劑量組在0～4h內(nèi)收縮壓（SBP）有明顯降低，并在4h時達到最大降壓值，最多下降了29.000mm Hg，4h后SBP開始逐漸上升，8h恢復原值，而高劑量組是在5h達到最低后逐漸上升的。統(tǒng)計結(jié)果顯示，低、中和高劑量組與對照組相比，p＜0.05，因此三個劑量的灌胃組與對照組均有顯著性差異。

圖8 單次灌胃脫苦試樣9的超濾物對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.8 Antihypertensive effect of single administration of debittering sample 9 with ultrafiltration on the SBP of SHR

由圖9可知，正常鼠灌胃高劑量的脫苦試樣9的超濾物后，在0～8h內(nèi)SBP無顯著變化。T檢驗結(jié)果也顯示，灌胃高劑量的脫苦試樣9的超濾物與空白對照組相比無顯著性差異（p＞0.05）。

2.5 連續(xù)灌胃酪蛋白水解產(chǎn)物的實驗結(jié)果

圖9 單次灌胃脫苦試樣9超濾物對Wistar大鼠血壓變化的影響Fig.9 Antihypertensive effect of single administration of debittering sample 9 with ultrafiltration on the SBP of Wistar

2.5.1 連續(xù)灌胃酪蛋白雙酶水解產(chǎn)物和超濾物對SHR大鼠的影響 降壓肽效果如何，除了考察其是否能有顯著的降壓作用，還有一個重要的方面就是考察其降壓的穩(wěn)定性，因此在單次灌胃實驗的基礎上，根據(jù)2.4.1和2.4.2選用中劑量的酪蛋白雙酶水解產(chǎn)物和超濾物進行了連續(xù)灌胃實驗，考察其降壓的穩(wěn)定性。由圖10可知，在第1次灌胃2h后血壓有顯著的降低，降幅達到12.875mm Hg和16.000mm Hg，在4h灌胃后測定血壓分別降低了22.500、28.625mm Hg，然后進行第2次灌胃。

圖10 連續(xù)灌胃酪蛋白雙酶水解物及其超濾物對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.10 Antihypertensive effect of continuous administration of casein bi-enzymatically hydrolysates and its ultrafiltration products on the SBP of SHR

在第2次灌胃后2h和4h，即圖10中的6h和8h時血壓仍處于較低的水平，灌胃酪蛋白雙酶水解物的分別比初始血壓值降低了21.500mm Hg和22.625mm Hg，灌胃超濾物的分別比初始血壓值降低了28.375mm Hg和28.875mm Hg。各測定點與初始點相比較有顯著性的差異（p＜0.01）。這表明每隔4h灌胃1次，可長時間的維持較低水平的血壓值，酪蛋白雙酶酶解產(chǎn)物具有很好的穩(wěn)定性，這為轉(zhuǎn)化成抗高血壓功能性食品提供了有力的數(shù)據(jù)及理論支持。

2.5.2 連續(xù)灌胃試樣9和試樣9的超濾物對SHR大鼠的影響 由圖11可知將中劑量的試樣9及其超濾物分別用于灌胃SHR大鼠，在第1次灌胃2h后血壓有顯著的降低，降幅達到13.625、15.125mm Hg，在4h灌胃前測定血壓為降低了17.875、26.125mm Hg，然后進行第2次灌胃。

圖11 連續(xù)灌胃脫苦試樣9及其超濾物對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.11 Antihypertensive effect of continuous administration of debittering sample 9 and its ultrafiltration on the SBP of SHR

第二次灌胃在6h和8h時血壓仍處于較低的水平，灌胃試樣9分別比初始血壓值降低了17.500mmHg和17.750mm Hg，灌胃試樣9的超濾物分別比初始血壓值降低了26.250mm Hg和25.875mm Hg。各測定點與初始點相比較有顯著性的差異（p＜0.01）。這表明酪蛋白雙酶水解物的脫苦試樣9及其超濾物具有很好的穩(wěn)定性。

2.6 單次灌胃功能性酸奶對SHR大鼠的影響

2.6.1 正常發(fā)酵乳對SHR降壓效果的影響 將發(fā)酵乳灌胃SHR大鼠后，從圖12可以看出在0～8h內(nèi)收縮壓有明顯降低（p＜0.05），在3h降到最低下降了8.625mm Hg，這表明發(fā)酵對乳制品產(chǎn)生了影響使其產(chǎn)生了降壓物質(zhì)，這可能由于乳酸菌的胞外蛋白酶能限制性的水解乳蛋白質(zhì)在發(fā)酵液中可得到一些活性多肽[21]。由圖13可知，正常鼠灌胃發(fā)酵乳后，在0～8h內(nèi)SBP無顯著變化。T檢驗結(jié)果也顯示，灌胃發(fā)酵乳與空白對照組相比無顯著性差異（p＞0.05）。

圖12 單次灌胃普通發(fā)酵乳對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.12 Antihypertensive effect of single administration of ordinary fermented milk on the SBP of SHR

圖13 單次灌胃正常發(fā)酵乳對Wistar大鼠血壓變化的影響Fig.13 Antihypertensive effect of single administration of ordinary fermented milk on the SBP of Wistar

2.6.2 單次灌胃加入超濾物、試樣9、試樣9超濾物的發(fā)酵乳對SHR大鼠的影響 由圖14可知，SHR大鼠在灌胃加入中劑量的超濾物、試樣9、試樣9的超濾物發(fā)酵乳后，在0～8h內(nèi)收縮壓（SBP）有明顯降低，分別在4、4、5h時達到最大降壓值，最多下降了36.875、23.375、31.875mmHg，隨后SBP開始上升逐漸恢復原值。

圖14 單次灌胃功能性發(fā)酵乳對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.14 Antihypertensive effect of single administration of functional fermented milk on the SBP of SHR

2.7 連續(xù)灌胃功能性發(fā)酵乳對SHR大鼠的影響

由2.6.2可知加入超濾物和試樣9的超濾物制成的功能性發(fā)酵乳的降壓效果最為顯著，故將兩種功能性發(fā)酵乳對SHR大鼠進行連續(xù)灌胃，結(jié)果如圖15所示。加入中劑量超濾物制成的功能性發(fā)酵乳灌胃SHR大鼠在第1次灌胃2h后血壓有顯著的降低，降幅達到16.375mmHg，在4h灌胃前測定血壓為降低了35.375mmHg，然后進行第2次灌胃，在6h和8h時血壓仍處于較低的水平，分別比初始血壓值降低了32.250mmHg和33.250mmHg。各測定點與初始點相比較有顯著性的差異（p＜0.01）。加入中劑量試樣9超濾物制成的功能性發(fā)酵乳灌胃SHR大鼠在第1次灌胃2h后血壓有顯著的降低，降幅達到15.125mm Hg，在4h灌胃前測定血壓為降低了33.500mm Hg，然后進行第2次灌胃，在6h和8h時血壓仍處于較低的水平，分別比初始血壓值降低了32.750mm Hg和29.875mm Hg。各測定點與初始點相比較有顯著性的差異（p＜0.01）。

圖15 連續(xù)灌胃加入超濾物的發(fā)酵乳對SHR大鼠血壓變化的影響Fig.15 Antihypertensive effect of continuous administration of functional fermented milk on the SBP of SHR

3 結(jié)論

實驗利用酪蛋白為原料，模擬人體胃腸道環(huán)境選取胃蛋白酶和胰蛋白酶對其進行水解得到富含ACE抑制肽的水解物，由于得到的酪蛋白水解物是一個多肽混合體系，一般而言，生物活性肽的分子量小于6000ku[22]，故對其用6ku的中空纖維膜進行超濾使其中的ACE抑制肽得到富集，雖然酶法水解蛋白質(zhì)可得到多種具有高ACE抑制活性的ACE抑制肽，但在水解的同時也會相應的有苦味肽的形成，這使得產(chǎn)品無法滿足口感和嗜好的要求從而限制了短肽在食品工業(yè)領域的應用[23-24]。

本研究采用風味酶法對雙酶水解物進行脫苦，選擇出對其ACE抑制活性影響最小的脫苦試樣，并對其進行超濾得到脫苦試樣的超濾物。將得到的四種物質(zhì)分別灌胃SHR和Wistar大鼠進行抗高血壓效果驗證。結(jié)果表明四種物質(zhì)灌胃SHR大鼠的最低降壓幅度分別為22.630、33.375、19.375、29.000mm Hg，而對正常的Wistar大鼠無降低血壓作用，這表明所得的水溶性提取物對于正常血壓不會有影響，其作用是有針對性的。兩種超濾物質(zhì)不僅灌胃劑量遠遠低于兩種水解物，且降壓效果高于這兩種水解物，故選擇兩種超濾物制備功能性發(fā)酵乳灌胃SHR大鼠，制得的兩種發(fā)酵乳都在4h達到最低值分別下降了36.875、31.875mm Hg。且連續(xù)灌胃兩種功能性發(fā)酵乳可以在8h內(nèi)維持較低的血壓。利用富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物制備的功能性發(fā)酵乳在控制和治療高血壓方面有一定的效果，這為以后食源性降壓食品的開發(fā)提供了一定的依據(jù)。

[1] 揭紅波. 淺談心血管疾病的發(fā)病機理與預防[J]. 中外醫(yī)療，2011（5）：184.

[2] 陳紹行，沈衛(wèi)峰. 高血壓治療現(xiàn)狀[J]. 國際心血管病雜志，2006，33（2）：67-69.

[3] CHOBANIAN A V，BAKRLS G L，BLACK H R，et al. Seventh report of the joint national committee on prevention，detection，evaluation and treatment of high blood pressure[J]. Hypertension，2003，42（2）：1206-1252.

[4] Guidelines Committee. European Society of Hypertension-European Society of Cardiology guidelines for the management of arterial hypertension[J]. Hypertension，2003，21（6）：1011-1053.

[5] 中國高血壓防治指南修訂委員會.2004年中國高血壓防治指南[J]. 中華心血管病雜志，2004，32（12）：1060-1064.

[6] 張元宏. 高血壓病的藥物治療新進展[J]. 實用醫(yī)技雜志，2007，14（3）：382-385.

[7] 張源淑，鄒思湘. 酪蛋白源生物活性肽[J]. 國外畜牧科技，1998，25（4）：33-36.

[8] WU J P，DING X L. Characterization of inhibition and stability of soy-protein derived angiotensinⅠ-converting enzyme inhibitory peptides[J]. Food Research International，2002，35（4）：367-372.

[9] EIJI E. Resistance to gastrointestinal proteases of the short chain peptides has reductive effect in blood pressure[J]. Nippon Shkuhin Kagaku Kogaku Kaishi，1996，43（5）：520-525.

[10] HAILESLASSIE S S，LEE B H，GIBBS B F. Purification and identification of potentially bioactive peptides from enzymemodified cheese[J]. J Dairy Sci，1999，82：1612-1617.

[11] 林汝法，陜方，宋金翠，等. 酶法水解苦蕎麩皮蛋白生產(chǎn)降血壓肽[J]. 食品科學，2004，25（11）：207-209.

[12] MATSUMOTO H，SHIMOKAWA Y，USHIDA Y，et al. New biological function of bovine α -lactalbumin：protective effect against ethanol-and stress-induced gastric mucosal injury in rats[J]. Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2001，65（5）：1104-1111.

[13] MARUYAMA S，SUZUKI H. A peptide inhibitor of angiotensin Ⅰ-converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein[J]. Agric Biol Chem，1982，46（5）：1393-1394.

[14] 張艷，胡志和，閆星，等. 胃蛋白酶水解酪蛋白制備ACE抑制肽的條件[J]. 食品科學，2010，31（14）：42-46.

[15] MIGUEL M，CONTETAS M M，RECIO I，et al. ACEinhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J]. Food Chemistry，2009，112（1）：211-214.

[16] 趙駿，宮霞，郭本恒. 乳酪蛋白源ACE抑制肽的分離純化[J]. 中國乳品工業(yè)，2006，34（6）：8-11.

[17] 田波，霍貴成. 超濾法分離酪蛋白酶解物中的ACE抑制肽[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（10）：59-61.

[18] 申曉文，牟光慶. 酪蛋白源ACE抑制肽的評價方法和研究進展[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（9）：375-381.

[19] CUSHMAN D W，CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology，1971，20：1637-1648.

[20] 張燕，王紅英，胡艷君，等. SHR大鼠血壓尾套法測定影響因素探討[J]. 西北藥學雜志，2008，23（2）：34-42.

[21] 王海燕，張佳程. 食品降壓肽的比較與評價方法[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（11）：70-73.

[22] XU Ruojun. Bioactive peptides in milk and their biological and health implications[J]. Food Rev Int，1998，14（1）：1-9.

[23] 何慧，王進，裴凡，等. 蛋白質(zhì)水解物與苦味的構(gòu)效關系及脫苦研究[J]. 食品科學，2006，27（10）：571-574.

[24] 唐傳核，彭志英. 大豆蛋白水解物的苦肽以及脫除方法進展[J]. 中國油脂，2000，25（6）：167-172.