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      堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼酶法生產(chǎn)低聚木糖的研究

      2013-08-07 09:13:14侯麗芬孫向陽丁長河
      食品工業(yè)科技 2013年10期
      關(guān)鍵詞:棉籽殼木糖聚糖

      侯麗芬,孫向陽,丁長河

      (1.鄭州旅游職業(yè)學(xué)院,河南鄭州450009;2.鄭州牧業(yè)工程高等??茖W(xué)校,河南鄭州450011;3.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州450052)

      低聚木糖是功能性低聚糖的一種,具有很強(qiáng)的促雙歧桿菌增殖能力,在促進(jìn)人體自身健康、傳統(tǒng)食品工業(yè)的高新技術(shù)改造、廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品的高附加值轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重要作用。隨著人們對低聚木糖的功能性認(rèn)識的提高,低聚木糖的應(yīng)用范圍會越來越廣,它的市場需求也將逐年增加,發(fā)展前景十分廣闊[1]。木聚糖為生物大分子,在自然狀態(tài)多與其他成分如木質(zhì)素復(fù)合存在。木質(zhì)素被認(rèn)為是酶降解植物細(xì)胞壁的限制因子[2-4],并且現(xiàn)已證實(shí)木聚糖與木質(zhì)素是通過共價(jià)鍵連接的,其具體連接方式為:木聚糖的阿拉伯糖殘基和葡萄糖醛酸殘基同木質(zhì)素的苯環(huán)通過共價(jià)鍵連接在一起[5-7]。在酶法生產(chǎn)低聚木糖的過程中,與木聚糖結(jié)合的成分會妨礙木聚糖酶的活性中心與木聚糖的接近,影響木聚糖的水解效果,進(jìn)而影響低聚木糖的生成速度和最終產(chǎn)品的得率。因此在進(jìn)行木聚糖的水解之前,必需對原料進(jìn)行處理以削弱木聚糖與其他成分之間的結(jié)合力,從而大大提高酶解生產(chǎn)低聚木糖的效率。本研究以棉籽殼為原料,在堿性H2O2條件下對棉籽殼進(jìn)行處理,通過木聚糖酶降解木聚糖制備低聚木糖,以期為有關(guān)低聚木糖生產(chǎn)與開發(fā)研究提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料與設(shè)備

      棉籽殼 產(chǎn)地河南省省民權(quán)縣,已經(jīng)粉碎成直徑2mm及以下的顆粒,水分:9.2%,灰分:3.4%;木聚糖酶 BR,Novozymes;3,5-二硝基水楊酸、乙腈 為分析純;其他試劑 為化學(xué)純。

      Gel Plate F 254硅膠板 Merck公司;紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯有限公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 堿性H2O2預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化 稱取一定量的原料,加入10倍體積,pH11.5(4mol/L NaOH調(diào))H2O2溶液。

      1.2.1.1 堿性H2O2的濃度 堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼:30℃條件下預(yù)處理12h;實(shí)驗(yàn)濃度選擇0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和4.0%。

      1.2.1.2 堿性H2O2預(yù)處理時(shí)間 堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼:堿性H2O2濃度2.5%,30℃條件下;預(yù)處理選擇時(shí)間為4、6、8、10、12、24h。

      1.2.1.3 堿性H2O2預(yù)處理溫度 堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼:堿性H2O2濃度2.5%,預(yù)處理12h;預(yù)處理選擇溫度:30、40、60、80、100℃。

      上述預(yù)處理之后,用清水洗至洗出液呈中性,烘干,待用。

      1.2.2 酶解參數(shù)的選擇和酶解效果的測定

      1.2.2.1 底物的濃度 選擇0.05mol·L-1,pH5.8的檸檬酸緩沖溶液為底物的浸泡液。固定加酶量為原料重量的3.0%,酶解時(shí)間為24h。棉籽殼為底物其料液比:1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(W/V)。

      1.2.2.2 加酶量和酶解時(shí)間 棉籽殼底物固液比:1∶15(W/V)的前提下,選擇加酶量為底物重量的1%、2%、3%、4%和5%;在每個(gè)加酶量條件下選取酶解時(shí)間:0、0.5、1、2、4、8、12、24h。

      1.2.3 樣品中木聚糖含量的測定 500mg待測樣品置于研缽中,加入72%(W/W)的硫酸,研磨1h至樣品完全呈均勻乳狀,將研磨的乳漿狀物全部轉(zhuǎn)入容量瓶中并定容。充分混合均勻后,濾紙過濾,清液用地衣酚-鹽酸法測定總糖含量(mg),按下式計(jì)算木聚糖含量。

      木聚糖含量(%)=測定總糖含量×250×0.88/500×100

      1.2.4 可溶性木聚糖的測定 地衣酚-鹽酸法。取出提取液若干,加蒸餾水進(jìn)行稀釋至1mL,然后,加入3mL 0.1%的三氯化鐵、0.3mL的1%的地衣酚溶液,加入2mL的蒸餾水,在試管振蕩器上搖勻,沸水浴30min,冷卻,580、670nm測其吸光度。計(jì)算兩者吸光度的差值,代入差值方程,計(jì)算其含量。

      木聚糖提取率(%)=可溶性木聚糖含量/原料×100

      木聚糖的水解率(%)=酶解后所測得溶液中的木聚糖含量(地衣酚-鹽酸法×0.88)/原料中木聚糖含量×100。

      1.2.5 還原糖的測定[8]采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法,具體方法如下:取出提取液若干,加蒸餾水稀釋,然后加DNS試劑,搖勻,沸水浴15min后,立即加入40%的酒石酸鉀鈉,搖勻,冷卻10min,在540nm下測其吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)方程,計(jì)算其含量。

      1.2.6 糖液中的成分組成確定方法 薄層層析法(TLC)[9]。選擇乙腈和水為展開劑,乙腈∶水=85∶15;顯色劑選擇用5%的硫酸甲醇溶液。樣品上樣量為1.4~4.0μL,展開時(shí),薄層層析板沒入展開劑5mm左右,兩次展開。顯色劑潤濕后置于130℃烘箱中烘5min左右。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 堿性H2O2預(yù)處理各因素的確定

      堿性H2O2去除不同原料中木質(zhì)素的效果對于pH的依賴性較強(qiáng),據(jù)有關(guān)報(bào)道最適pH為11.5~11.6,如果在堿性更強(qiáng)的條件下其木質(zhì)素的去除率基本上保持不變[10-12]。因此,堿性H2O2溶液的pH確定為11.5。

      2.1.1 H2O2濃度的確定

      2.1.1.1 不同H2O2濃度對木聚糖含量的影響 選擇不同的H2O2濃度,30℃條件下預(yù)處理12h,棉籽殼的木聚糖含量變化如圖1所示。

      經(jīng)不同濃度的H2O2處理后的棉籽殼木聚糖含量,在0%~1.0%范圍內(nèi)增幅較大,在1.0%~2.5%范圍內(nèi),木聚糖含量較為穩(wěn)定,而在2.5%~4.0%范圍內(nèi),木聚糖含量又有較大的增幅。這可能是由于棉籽殼中木質(zhì)素含量較高(17.4%),一部分木質(zhì)素在較低的H2O2濃度范圍內(nèi)(0%~1.0%)就可以除去,而另一部分需要更高的H2O2濃度(2.5%~4.0%)才能去除掉。

      圖1 不同濃度H2O2處理棉籽殼的木聚糖含量的影響Fig.1 Effect of cottonseed husk treated with different concentration H2O2 on xylan content

      2.1.1.2 不同H2O2濃度對酶解效果的影響 經(jīng)過不同濃度H2O2預(yù)處理后的棉籽殼加木聚糖酶(3%),酶解相同時(shí)間(8h),其相對應(yīng)的木聚糖提取率和還原糖含量如圖2所示。由圖2中可以看出,木聚糖提取率和還原糖含量隨著H2O2濃度的增大而升高。圖2中棉籽殼的木聚糖提取率和還原糖含量在H2O2濃度為2.0%時(shí),是速率增加的轉(zhuǎn)折點(diǎn);在此點(diǎn)之后其增加速率均減慢。

      圖2 不同H2O2濃度對棉籽殼酶解效果的影響Fig.2 Effect of concentration of H2O2 on the effects of enzymatic hydrolysis of cottonseed husk

      經(jīng)過堿性H2O2預(yù)處理后的棉籽殼在不同濃度條件下的木聚糖水解率如圖3所示。H2O2濃度在0.5%~2.5%范圍內(nèi)時(shí),棉籽殼的水解率隨著H2O2濃度的增加而增加,且木聚糖水解率增加幅度較大,而在2.5%之后,木聚糖水解率隨著H2O2濃度的增加而降低。棉籽殼的水解率在H2O2濃度為2.5%時(shí)最大,因此預(yù)處理棉籽殼的H2O2濃度選為2.5%。

      圖3 不同H2O2濃度對棉籽殼木聚糖水解率的影響Fig.3 Effect of concentration of H2O2 on cottonseed husk xylan hydrolysis rate influence

      2.1.2 H2O2預(yù)處理時(shí)間的確定 不同預(yù)處理時(shí)間對棉籽殼木聚糖含量的影響如圖4所示。不同預(yù)處理時(shí)間處理后的棉籽殼木聚糖含量隨著處理時(shí)間的延長而提高,提高的幅度越來越小。但是隨著預(yù)處理時(shí)間的延長預(yù)處理后的棉籽殼顏色較淡,對于后期的低聚木糖糖液的純化工藝較為有利。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)原料顏色的變化程度而選擇預(yù)處理時(shí)間為12~14h。

      圖4 預(yù)處理時(shí)間對棉籽殼木聚糖含量的影響Fig.4 Effect of pretreatment time on cottonseed husk xylan content

      2.1.3 預(yù)處理溫度的確定 堿性H2O2預(yù)處理溫度對棉籽殼木聚糖含量的影響如圖5所示。隨著H2O2預(yù)處理溫度的不斷升高,預(yù)處理后的棉籽殼木聚糖含量也漸漸提高,但是其木聚糖含量的升高幅度不大。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是由于棉籽殼本身含有較多的木質(zhì)素(17.4%),使得木聚糖在堿性條件下很難溶出,其木聚糖含量隨著木質(zhì)素等物質(zhì)的去除而略有增大。因此,堿性H2O2預(yù)處理溫度對棉籽殼木聚糖含量影響不大。實(shí)際生產(chǎn)中為了節(jié)省能耗、降低成本,堿性H2O2預(yù)處理溫度選擇30℃。

      堿性H2O2法預(yù)處理?xiàng)l件經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)選為:濃度2.5%,時(shí)間12~14h,溫度30℃。在此條件下預(yù)處理得到的棉籽殼木聚糖含量31.7%,這對于木聚糖的提取率是非常重要的。

      圖5 預(yù)處理溫度對棉籽殼木聚糖含量的影響Fig.5 Effect of pretreatment temperature on cottonseed husk xylan content

      2.2 預(yù)處理后原料酶解條件的研究

      2.2.1 底物濃度的確定 預(yù)處理后的棉籽殼在不同的料液比下,水解反應(yīng)24h得到的木聚糖糖提取率和總還原糖如圖6所示。

      圖6 料液比對棉籽殼木聚糖提取率和還原糖總量的影響Fig.6 Effect of the ratio of solid to liquid on cottonseed husk xylan extraction rate and total reducting sugar content

      從圖6可以看出,當(dāng)料液比為1∶20的條件下,木聚糖的提取率和還原糖總量達(dá)到最高20.0%和150.2mg。當(dāng)料液比1∶20到1∶30時(shí),木聚糖的提取率和還原糖總量均降低,這可能是因?yàn)樵诘偷孜餄舛葧r(shí),底物中含有的可被有效水解的木聚糖組分較少,因此影響其最終得到的糖化率和還原糖含量。底物濃度對酶促反應(yīng)具有很大的影響,當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)小于Km值時(shí),酶反應(yīng)速度與底物濃度成線性關(guān)系,提高底物濃度可以提高反應(yīng)速度。從生產(chǎn)的角度來考慮,底物濃度高對生產(chǎn)成本的降低有好處。棉籽殼在料液比為1∶15和1∶20條件下,木聚糖的提取率和還原糖總量很接近,分別達(dá)到19.6%、149.6mg和20.0%、150.2mg,因此,為了降低實(shí)際生產(chǎn)成本,選擇底物濃度固液比1∶15比較合適。

      2.2.2 加酶量和酶解時(shí)間的確定 棉籽殼選擇在加酶量1%、2%、3%、4%和5%(相對于棉籽殼干物料)基礎(chǔ)上反應(yīng)0~24h,所得到的木聚糖提取率和還原糖含量如圖7、圖8所示。木聚糖的提取率和還原糖的含量隨著加酶量的增加而增加。棉籽殼在加酶量1%、2%、3%、4%和5%基礎(chǔ)上反應(yīng)24h時(shí),其木聚糖提取率和還原糖含量分別為7.5%、15.9%、18.3%、19.7%、22.1%和5.9、9.6、10.1、10.8、10.8mg·mL-1。在加酶量達(dá)到5%時(shí),酶解所得到棉籽殼的木聚糖水解率為69.8%,而加酶量為3%時(shí),酶解所得到的棉籽殼木聚糖水解率是57.8%,比加酶量5%時(shí)水解率低12.0%。

      圖7 棉籽殼在不同加酶量、不同水解時(shí)間下的木聚糖提取率Fig.7 Extraction rate of xylan of cottonseed husk in different enzyme concentration,hydrolysis time

      圖8 棉籽殼在不同加酶量、不同反應(yīng)時(shí)間下的還原糖含量Fig.8 Reducing sugar content of cottonseed husk in different enzyme,different reaction time

      雖然加酶量在5%時(shí)得到的棉籽殼木聚糖提取率非常高,但是棉籽殼加酶量5%與3%得到的還原糖含量僅相差0.7mg·mL-1。另外,由于商業(yè)酶價(jià)格較為昂貴,所以根據(jù)圖7、圖8加酶量與木聚糖提取率和還原糖增加的趨勢選擇加酶量為3%。

      2.2.3 酶解液薄層層析色譜圖(TLC) 棉籽殼加酶量3%的酶解效果TLC圖見圖9,從圖9可以看出,對照低聚木糖標(biāo)樣,隨著酶解時(shí)間的延長生成的木二糖越多,但是單糖的含量并沒有明顯的增加。另外,如果在反應(yīng)24h基礎(chǔ)上讓反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行,可能會在50℃這樣一個(gè)微生物比較容易生長的環(huán)境下糖液被污染,而且酶解時(shí)間過長勢必增加生產(chǎn)周期也不利于提高生產(chǎn)效率,因此,木聚糖酶的酶解時(shí)間可以選為24h。

      圖9 木聚糖酶(3%)酶解棉籽殼的TLC圖(s為低聚木糖標(biāo)樣)Fig.9 Xylanase(3%)enzymatic hydrolysis of cottonseed husk TLC diagram

      3 結(jié)論

      堿性H2O2法預(yù)處理?xiàng)l件為:濃度2.5%,時(shí)間12~14h,溫度30℃。在此條件下預(yù)處理得到的棉籽殼木聚糖含量31.7%。另外,在料液比1∶15的濃度下,加酶量為3%,50℃(木聚糖酶的最適溫度)酶解24h時(shí),棉籽殼的木聚糖提取率和水解率為18.3%和57.8%。

      棉籽殼是農(nóng)業(yè)纖維廢棄物,利用棉籽殼制備功能性低聚木糖,在資源利用、環(huán)境保護(hù)以及促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)調(diào)整等方面均具有重要意義。本研究通過堿性H2O2對棉籽殼進(jìn)行處理,木聚糖酶降解木聚糖制備低聚木糖,達(dá)到了較理想的提取率和水解率,為有關(guān)低聚木糖生產(chǎn)與開發(fā)研究提供了參考。

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