標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定茯神中多糖的含量

張 捷，黃榮花，張書華

(陜西省銅川市藥品檢驗(yàn)所，陜西 銅川 727031)

茯神為多孔菌科臥孔屬植物茯苓 Poria cocos Schw.Wolf的菌核，原物種為低等植物，是寄生在松樹上的真菌，藥用部分為菌核中間抱有松根的白色部分。茯神性平，味甘、淡，有滲濕、健脾、寧心等功能，用于痰飲、水腫、小便不利、泄瀉、心悸、眩暈。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，茯神具有養(yǎng)心凝神的功效，用于心神失養(yǎng)所致的心悸怔忡、失眠多夢等神志不寧的虛證，并常與補(bǔ)血養(yǎng)心藥同用，以增強(qiáng)療效。茯神對(duì)健忘病患者也有一定的輔助治療作用，另外對(duì)小便不利患者也有緩解作用[1]。本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[2]測定茯神藥材中多糖的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Evolution 500型紫外分光光度計(jì);AY－220型電子天平。D－無水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)為110833－200904，中國藥品生物制品檢定所);茯神藥材樣品的產(chǎn)地分別為湖南、湖北大別山、陜西漢中。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥14 h的 D－無水葡萄糖對(duì)照品0.0201 g，置20 mL容量瓶中，加純化水溶解至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液(每1 mL含D－無水葡萄糖1.005 mg)。取本品粗粉約1 g，精密稱定，加80%乙醇100 mL回流2 h，趁熱濾過，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，棄去乙醇液;將殘?jiān)盀V紙置燒瓶中，加水150 mL，在水浴鍋上回流2 h，趁熱濾過，用熱水洗滌4次，放冷，加水定容至250 mL，即得供試品溶液。

2.2 測定方法

精密量取樣品1 mL，置具塞試管中補(bǔ)加水至2 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，迅速精密加硫酸5 mL，依法測定吸光度，計(jì)算含量。

2.3 檢測波長選擇

取供試品(含量為 29.982 mg/g)，用 Evolution 500型紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果供試品在490 nm波長處有最大吸收。

2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:精密量取對(duì)照品貯備液10 mL，置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 分別置具塞試管中，補(bǔ)加水至 2 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加硫酸5 mL，搖勻，待其反應(yīng)10 min，置40℃的水浴鍋中保溫15 min，取出后迅速冷卻至室溫(分別含 D － 無水葡萄 為 20.1，40.2，60.3，80.4，100.5 μg)。以對(duì)照品 0 mL 試管內(nèi)的溶劑為空白，照紫外可見分光光度法(附錄ⅤA)，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=15.661 7 X －0.082 8，r=0.999 9。結(jié)果表明，D － 無水葡萄糖質(zhì)量在20.1～100.5 μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密量取對(duì)照品溶液，依法測定吸光度，連續(xù)測定6次。結(jié)果的 RSD為0.145%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密稱取供試品1 g，依法制備供試品溶液，每間隔2 h測定1次(n=6)。結(jié)果的 RSD為0.549%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同批樣品6份，按供試品溶液的制備方法操作。結(jié)果多糖平均含量為30.007 mg/g，RSD為0.514%。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的同一批樣品(含量為30.007 mg/g)約1 g，精密稱定，加入一定量的對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制備溶液，平行試驗(yàn)5次，依法測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測定

取本品粗粉約1 g，精密稱定，按擬訂方法制備供試品溶液，并依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液茯神中多糖的濃度，計(jì)算，即得。結(jié)果見表2。

表2 茯神中多糖含量測定結(jié)果

3 討論

多糖的檢測方法一般可分為兩大類:一類是直接測定多糖本身，如高效液相色譜法和酶法，但需要有多糖的標(biāo)樣，而且測定結(jié)果偏低;另一類是通過顯色反應(yīng)測定吸光度值，即比色法，如水楊酸法、斐林法、苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法等。其中，苯酚－硫酸法由于方法簡單、快速，試驗(yàn)成本較低，且無需多糖純品等優(yōu)點(diǎn)被廣泛采用。此法是先用標(biāo)準(zhǔn)品多糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，再通過多糖的顯色反應(yīng)測定吸光度，根據(jù)其在曲線上的位置推算出多糖的濃度從而推算其含量。本試驗(yàn)的平均回收率在101.3% ～103.6%之間，精密度試驗(yàn)的 RSD在5%以內(nèi)，說明以 D－無水葡萄糖為對(duì)照品，用苯酚－硫酸法測定茯神中多糖的含量可行。

試驗(yàn)中的苯酚要用蒸餾酚，又稱重蒸酚或重苯酚，其純度高，可用作試驗(yàn)中定量分析試劑，本試驗(yàn)中就是用苯酚重蒸餾后得到的餾分。另外，試驗(yàn)中試劑的加入順序要正確，先加入待測液，再加入5%苯酚液后，迅速加入濃硫酸，搖勻，待其反應(yīng)10 min，置40℃的水浴鍋中保溫15 min，取出后迅速冷卻至室溫。

多糖作為一類重要的生物活性物質(zhì)，具有多種藥用功能，在抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、愈潰瘍等治療方面已顯示出誘人前景。隨著多糖藥理學(xué)及臨床學(xué)研究的不斷深入，含多糖類藥物將具有更廣闊的開發(fā)前景。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上海人民出版社，1977:1 597.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄30.