RNAi沉默Notch1基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞MG63的促凋亡作用

吳德明，楊志強(qiáng)，劉 翔，江 川，戴 閩

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006)

骨肉瘤是是兒童和青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，致殘率及病死率均高。盡管近年來骨肉瘤的診斷、治療水平有了很大的提高，但骨肉瘤保肢治療效果遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度。Notch信號通路是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間直接接觸的主要信號通路之一，調(diào)控多細(xì)胞機(jī)體的細(xì)胞增殖、分化和凋亡［1～3］。人類許多腫瘤中均可檢測到Notch信號通路活性的改變，由于腫瘤來源及其微環(huán)境的不同，Notch信號通路具有促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的雙重作用［4，5］。近年來，特異性阻斷 Notch信號通路從而起到抗腫瘤作用，已作為腫瘤治療的新途徑受到了廣泛關(guān)注［6，7］。Notch1 基因是 Notch 信號通路中的重要組成部分，沉默其表達(dá)將明顯抑制Notch信號通路的功能［8，9］。2011年3月 ～2012年 5月，本實(shí)驗(yàn)通過觀察沉默Notch1基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞MG63增殖和凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為今后通過抑制Notch信號通路治療骨肉瘤提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人骨肉瘤細(xì)胞系MG63由武漢大學(xué)中國典型生物保藏中心提供，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 mNotch-1短發(fā)夾狀 RNA(mNotch-1 shRNA)片段的設(shè)計及合成:根據(jù)人Notch1基因的cDNA 序列(Genbank:NM_017617.3)，利用 Ambion公司在線設(shè)計軟件，設(shè)計出人Notch1基因RNA干擾(RNAi)片段(大連寶生物有限公司)。AnnexinVFITC試劑購自晶美生物工程有限公司，小牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Hyclone公司。兔抗人Notch1抗體購自美國ABcom公司，兔抗人Bcl-2和Bax抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司，PVDF膜為Millipore公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT比色法) 將MG63細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，加無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h，然后利用mNotch-1 shRNA處理細(xì)胞，利用MTT技術(shù)分析mNotch-1 shRNA轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染24、48、72 h時MG63細(xì)胞的增殖情況。加入新配制的MTT，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)，10 min后，利用酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度(A)值。根據(jù)公式:細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測 調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL，經(jīng) mNotch-1 shRNA 處理細(xì)胞 24、48、72 h，分別制成單細(xì)胞懸液，加AnnexinV-FITC室溫避光10 min，沖洗、離心、重懸細(xì)胞，加入 20 μg/mL PI，4℃避光30 min后上機(jī)檢測。對照組為mNotch-1 shRNA處理后即刻上機(jī)檢測(0 h)。每組設(shè)3個樣本。分析軟件計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 Western blot檢測相關(guān)目的蛋白表達(dá) 取經(jīng)mNotch-1 shRNA 處理24、48、72 h后的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106/mL，用胰蛋白酶消化液消化后，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，加入0.5 mL預(yù)冷蛋白裂解液，劇烈振蕩使細(xì)胞重懸。按比例加入1 mL蛋白抽提試劑，振蕩均勻，4℃靜置10 min。隨后12 000 r/min、4℃離心10 min，取中間相，最后用無水乙醇洗滌并沉淀蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白含量。取 100 μg總蛋白上樣于 10%SDSPAGE，電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加兔抗人 Notch1抗體(1∶500)、兔抗人 Bcl-2抗體(1∶800)和兔抗人Bax抗體(1∶800)4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(濃度1∶4 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑發(fā)光，定影、顯影，膠片曝光。用同樣方法以β-actin作上樣對照。利用Quantity One軟件分析測定條帶相對A值，并計算 ABcl-2/Aβ-actin和 ABax/Aβ-actin值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Pearson相關(guān)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNAi沉默Notch1基因?qū)侨饬黾?xì)胞MG63增殖的影響 mNotch-1 shRNA處理細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到不同程度抑制，抑制率與作用時間呈現(xiàn)明顯的依賴效應(yīng)，相關(guān)分析顯示兩者呈正相關(guān)(r=0.994，P ＜0.01)。MTT 檢測發(fā)現(xiàn)，mNotch-1 shRNA處理細(xì)胞24 h后，MG63細(xì)胞的抑制率為20%，48 h達(dá)到半數(shù)有效抑制率，在處理72 h后細(xì)胞抑制率達(dá)到最高值85%，不同時間處理組與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染mNotch-1 shRNA組MG63細(xì)胞的凋亡率隨著時間的延長而逐漸增加，在作用 24、48、72 h后，細(xì)胞凋亡率分別為19.4%、37.6%、51.6%，對照組細(xì)胞凋亡率為9.9%。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對照組均有明顯升高(P ＜0.05)，見圖1。

圖1 Annexin V-FITC染色檢測結(jié)果

2.3 Western blot檢測結(jié)果 mNotch-1 shRNA處理后，隨著時間的延長，MG63細(xì)胞中Notch1基因表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。另外阻斷Notch信號通路可以顯著抑制Bcl-2基因的表達(dá)并上調(diào)Bax基因的表達(dá)(P ＜0.05)，見圖2。

圖2 Western blot檢測 Notch1、Bcl-2和Bax基因的蛋白表達(dá)水平

3 討論

Notch信號通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，最早發(fā)現(xiàn)Notch信號通路與腫瘤有關(guān)是在1991年發(fā)現(xiàn)Notch1在急性T淋巴細(xì)胞白血病中起作用，目前人們在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)有 Notch信號的異常［10］。盡管Notch信號在少數(shù)腫瘤中表現(xiàn)出腫瘤抑制作用，但是其信號傳導(dǎo)的活化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。治療與Notch相關(guān)的腫瘤，可以把Notch信號傳導(dǎo)通路作為選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的活性靶點(diǎn)，通過阻斷Notch信號達(dá)到治療腫瘤的效果。本實(shí)驗(yàn)利用mNotch-1 shRNA處理體外培養(yǎng)的MG63細(xì)胞后，MTT結(jié)果顯示處理組細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，表明了在人骨肉瘤中阻斷Notch信號通路可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。

Kerr等于1972年首先提出細(xì)胞凋亡的概念。近年來隨著對凋亡分子機(jī)理的逐步認(rèn)識，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生是細(xì)胞增殖過度與凋亡減少導(dǎo)致過量蓄積的結(jié)果。Rieger等發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一條有效的腫瘤治療途徑。許多具有細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物都可以誘導(dǎo)凋亡，而且腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)抑制凋亡的相關(guān)基因變異，會減弱腫瘤對藥物的敏感性。本研究結(jié)果顯示，mNotch-1 shRNA處理MG63細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡增加，且隨著mNotch-1 shRNA處理的時間增加，細(xì)胞凋亡率隨之增加，與對照組比較，不同時間段均有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)合MTT結(jié)果，進(jìn)一步說明RNAi沉默Notch1基因能有效誘導(dǎo)人MG63細(xì)胞凋亡。這與 Fan 等［11］、Cuevas等［12］利用 γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號通路可誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相一致。

關(guān)于通過RNAi沉默Notch1基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，目前尚不十分明確。在諸多與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白中，已證實(shí)Bcl-2家族基因(Bcl-2和Bax等)的活性與細(xì)胞的生存和凋亡密切相關(guān)。人Bcl-2是大小為26 kD的跨膜蛋白，通過與Bcl-2家族成員之間的相互作用調(diào)控細(xì)胞的生存與凋亡［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNAi沉默Notch1基因可以有效降低MG63細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，并上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。而最近一項研究結(jié)果顯示，激活Notch信號通路可以抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果說明RNAi沉默Notch1基因誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2家族基因的表達(dá)有關(guān)。

但由于Notch信號通路有時起抑癌作用，有時起原癌基因的作用，必須分清Notch信號通路在特定腫瘤中的作用機(jī)制。雖然有關(guān)Notch信號通路在腫瘤發(fā)病機(jī)制和腫瘤治療中的作用尚有許多問題需要回答，但隨著研究的深入，Notch信號通路作為新一類抗腫瘤治療靶點(diǎn)將具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］ Ilagan MX，Kopan R.SnapShot:notch signaling pathway［J］.Cell，2007，128(6):1246.

［2］Ehebauer M，Hayward P，Arias AM.Notch，a universal arbiter of cell fate decisions［J］.Science，2006，314(5804):1414-1415.

［3］Hellstr?m M，Phng LK，Hofmann JJ，et al.Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis［J］.Nature，2007，445(7129):776-780.

［4］Cook M，Yu XM，Chen H.Notch in the development of thyroid C-cells and the treatment of medullary thyroid cancer［J］.Am J Transl Res，2010，2(1):119-125.

［5］Chen Y，Li D，Liu H，et al.Notch-1 signaling facilitates survivin expression in human non-small cell lungcancer cells［J］.Cancer Biol Ther，2011，11(1):14-21.

［6］Bao B，Wang Z，Ali S，et al.Notch-1 induces epithelial-mesenchymal transition consistent with cancer stem cell phenotype in pancreatic cancer cells［J］.Cancer Lett，2011，307(1):26-36.

［7］Park JT，Chen X，Tropè CG，et al.Notch3 overexpression is related to the recurrence of ovarian cancer and confers resistance to carboplatin ［J］.Am J Pathol，2010，177(3):1087-1094.

［8］Bin Hafeez B，Adhami VM，Asim M，et al.Targeted knockdown of Notch1 inhibits invasion of human prostate cancer cells concomitant with inhibition of matrix metalloproteinase-9 and urokinase plasminogen activator［J］.Clin Cancer Res，2009，15(2):452-459.

［9］Sj?lund J，Johansson M，Manna S，et al.Suppression of renal cell carcinoma growth by inhibition of Notch signaling in vitro and in vivo［J］.J Clin Invest，2008，118(1):217-228.

［10］Nickoloff BJ，Osborne BA，Miele L.Notch signaling as a therapeutic target in cancer:a new approach to the development of cell fate modifying agents［J］.Oncogene，2003，22(42):6598-6608.

［11］Fan X，Mikolaenko I，Elhassan I，et al.Notch1 and notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth［J］.Cancer Res，2004，64(21):7787-7793.

［12］Cuevas IC，Slocum AL，Jun P，et al.Meningioma transcript profiles reveal deregulated Notch signaling pathway［J］.Cancer Res，2005，65(12):5070-5075.

［13］Perumalsamy LR，Nagala M，Sarin A.Notch-activated signaling cascade interacts with mitochondrial remodeling proteins to regulate cell survival［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(15):6882-6887.