內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡在糖尿病大鼠腎臟組織中的作用

陳玉鳳，郭獻(xiàn)山，耿秀琴，張會娟

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453003;2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的慢性并發(fā)癥之一，是引起終末期腎功能衰竭的病因之一，嚴(yán)重影響著糖尿病患者生活質(zhì)量［1］。已有報道，糖尿病模型腎組織中細(xì)胞凋亡數(shù)較非糖尿病腎臟明顯增多，并伴有凋亡相關(guān)基因的改變［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是新發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)立于以往經(jīng)典的細(xì)胞膜受體或線粒體途徑的第 3條凋亡信號途徑［3］，以GRP78、Caspase12等作為ERS及相關(guān)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性蛋白。2010年4～11月，本研究通過應(yīng)用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠建立糖尿病模型［4］，觀察在不同病程階段，腎臟組織中的GRP78、Caspase12表達(dá)變化情況，探討ERS在DN中的作用及意義，為DN的發(fā)病機(jī)制及治療研究提供可能依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 血糖由德國艾柯夫公司Biosen血糖測量儀檢測，24 h尿蛋白排泄量(采用考馬斯亮藍(lán)法，考馬斯亮藍(lán)G250，上海超研生物科技有限公司)、血肌酐在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院化驗(yàn)室檢測。STZ(規(guī)格100 mg/支)，由美國Sigma公司提供，兔抗鼠GRP78多克隆抗體(編號為bs-1219P)、兔抗鼠Caspase12多克隆抗體(編號為bs-1105R)購自北京博奧森生物有限公司。SP試劑盒、DAB顯色劑購自北京中山生物技術(shù)公司，TRIzol reagent、RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RT-PCR引物合成于北京賽百盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 模型的建立及分組 32只清潔級健康雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d，禁食水12 h，隨機(jī)抽取 22 只，用溶于 0.1 mol/L、pH 4.0 檸檬酸/檸檬酸鈉溶液稀釋成1%的STZ溶液，按60 mg/kg一次性腹腔注射建立DM模型，72 h后尾部取血，以血糖＞16.7 mmol/L以上，定為糖尿病模型，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者予以剔除(n=2)，20只大鼠按飼養(yǎng)時間分為DM 6周、DM 12周組，余10只試驗(yàn)大鼠為對照組，用適量檸檬酸/檸檬酸鈉溶液腹腔注射，實(shí)驗(yàn)過程中不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 所有大鼠于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)室分籠飼養(yǎng)，每籠1只，以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料(購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心)喂養(yǎng)，自由飲水。飼養(yǎng)室內(nèi)保持良好通風(fēng)，室溫18～22℃、相對濕度45% ～65%。各組大鼠在相應(yīng)時段分批用代謝籠收集24 h尿液，測定24 h尿白蛋白排泄量;禁食12 h后用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，于腹主動脈采血，分離血清，測血糖、血肌酐水平。同時取出右側(cè)腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，留取一部分腎臟置于4%的甲醛固定液中，以待免疫組化檢查，剩余部分置于液氮中，再轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存以備提取RNA。

1.4 組織病理及免疫組織化學(xué)染色 腎臟組織用4%的甲醛溶液浸泡24 h，然后石蠟包埋后切成4 μm厚的薄片用來做HE染色和免疫組化。GRP78和Caspase12的檢測用SP法，按說明書步驟操作:脫蠟、漂洗、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性活氧化物酶，滴加封閉液，棄封閉液分別加抗 GRP78抗體和抗Caspase12抗體(羊抗大鼠多克隆抗體)，再加生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈親和素—過氧化物酶溶液漂洗，DAB液染色，蘇木素復(fù)染，用已知陽性結(jié)果作為陽性對照，用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，應(yīng)用BioSens digital imaging圖象分析軟件進(jìn)行分析，每張標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，計(jì)算平均光密度值來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 用原位末端標(biāo)記凋亡細(xì)胞(TUNEL法)檢測，按照原位凋亡試劑盒(TACSTMTDT Kit)進(jìn)行操作。光鏡下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡陽性細(xì)胞核呈棕黃色。細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的計(jì)算:每張陽性切片選取5個陽性細(xì)胞最多的高倍視野(400×)，計(jì)算500個腎臟細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比。腎臟AI=500個腎臟細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)/500個腎臟細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)。

1.6 半定量RT-PCR法 取腎臟組織100 mg加入1 mL Trizol充分均漿及彈打均勻提取總RNA。于紫外分光光度計(jì)上測定260 nm和280 nm波長處OD值，OD260/OD280在1.6 ～2.0 為所需 RNA 純度，計(jì)算其含量。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GRP78引物序列為:5'-GACCATGGAGAAAGCTGTAGAGA-3'，5'-CCAAGACACGTGAGCAACTGCTA-3'擴(kuò)增長度為373 bp;Caspase-12引物序列為:5'-TGGAGGTAAATGTTGGAGTG-3'，5'-GCTTGTGGATACCCAAATAG-3'，擴(kuò)增長度為584 bp;內(nèi)參 β-actin的引物序列為:5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'，擴(kuò)增長度為207 bp。擴(kuò)增條件如下:94℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán);94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán);72℃總延伸6 min。分別取PCR產(chǎn)物與緩沖液混合，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，目的基因mRNA的表達(dá)量以目的基因DNA條帶和β-actin的 DNA條帶灰度值比值計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用方差分析及獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中，對照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，體質(zhì)量增加明顯，毛色白而光澤。DM組大鼠出現(xiàn)被毛無光澤、飲水量偏多、尿量多、多食、體質(zhì)量偏輕，并隨著時間的延長，上述癥狀、體征加重，其中2只出現(xiàn)采血處潰爛(經(jīng)局部消毒后好轉(zhuǎn))。

2.2 生化指標(biāo)比較 與對照組比較，DM模型組血糖、血肌酐、24 h尿蛋白排泄量均高于對照組(P＜0.05);與DM 6周組比較，DM 12周組血肌酐、24 h尿蛋白排泄量均增高(P＜0.05)，而血糖在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖、尿蛋白排泄量、血肌酐的比較(ˉx±s)

2.3 腎臟組織病理學(xué)改變 HE染色顯示發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整，分層清晰，細(xì)胞形態(tài)比較完好;DM 12周組大鼠腎臟橫切面可見腎小球體積增大，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，分層紊亂，腎小管上皮細(xì)胞小灶樣萎縮，小動脈管壁增厚等，DM 6周組大鼠上述病理改變較輕。

2.4 原位細(xì)胞凋亡及免疫組化檢測 TUNEL陽性染色信號定位于腎臟細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色，體積等于或小于正常細(xì)胞核;正常細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。正常大鼠腎臟偶見細(xì)胞凋亡，DM 6周、DM 12周組大鼠凋亡細(xì)胞逐漸增多，在腎小球和腎小管中均可觀察到。DM 6周組腎臟細(xì)胞的AI高于對照組(P＜0.05)，DM 12周組腎臟細(xì)胞的AI高于DM 6周組(P＜0.05)。免疫組化檢測腎臟組織中存在 GRP78、Caspase12蛋白，陽性表達(dá)部位染色呈棕黃色，兩者的表達(dá)部位基本一致，主要位于腎小球、腎小管和間質(zhì)部位。對照組有少量表達(dá)，DM 6周組表達(dá)升高，DM 12周組升高更明顯(P＜0.05)。見表2。

表2 腎臟細(xì)胞AI與GRP78及Caspase12的表達(dá)(ˉx±s)

2.5 RT-PCR結(jié)果 DM 各組 GRP78、Caspase12 mRNA的表達(dá)較正常對照組增加(P＜0.05)，DM 12周組高于DM 6周組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織GRP78和Caspase12 mRNA相對表達(dá)量(ˉx ±s)

2.6 相關(guān)性分析 GRP78蛋白表達(dá)與24 h尿蛋白排泄量、血肌酐、Caspase12的蛋白表達(dá)、腎臟AI正相關(guān)(r=0.896、0.937、0.841、0.896，P=0.043、0.015、0.015、0.038).

3 討論

DN的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。文獻(xiàn)研究表明，細(xì)胞凋亡作為一原發(fā)和獨(dú)立的因素在DN的發(fā)病過程中起到不可忽視的作用［5］。細(xì)胞凋亡在DN早期可能對清除增生的多余細(xì)胞是有益的，但DN晚期腎臟細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目往往與腎功能惡化程度呈正比。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是重要的細(xì)胞器，它在蛋白質(zhì)的合成、翻譯后修飾、折疊組裝等方面起重要作用。缺氧、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+耗竭、蛋白質(zhì)加工異常、某些蛋白表達(dá)過多等各種刺激可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)機(jī)能障礙，激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，導(dǎo)致ERS［6］。適當(dāng)?shù)腅RS可通過促進(jìn)蛋白折疊、抑制蛋白合成來適應(yīng)應(yīng)激，但ERS持續(xù)存在或強(qiáng)度過大超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所能承受的范圍時，則會對細(xì)胞造成損傷或觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［7］。GRP78是ERS反應(yīng)的標(biāo)志性分子，半胱氨酸蛋白酶Caspase12途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的凋亡途徑［8］。Paschen 等［9］在 1996年提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能紊亂同細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Cybulsky等［10］強(qiáng)調(diào)ERS在腎小球損傷中的作用，認(rèn)為無論體外還是體內(nèi)因素刺激足細(xì)胞都可以誘導(dǎo)ERS。Toshiyuki等［11］將細(xì)胞破碎超速離心分為核、線粒體、微粒體(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜)、溶解碎片，經(jīng)免疫組織化學(xué)和Western印跡證實(shí)Caspase家族中僅Caspase12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。Mouw等［12］發(fā)現(xiàn)，敲除Caspase12的細(xì)胞雖然仍對其他各種凋亡誘導(dǎo)因素敏感，但對ERS誘導(dǎo)的凋亡卻產(chǎn)生耐受。Rammohan等［13］發(fā)現(xiàn)Caspase12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡，而其他死亡刺激仍可發(fā)生凋亡，這表明Caspase12與ERS介導(dǎo)的凋亡密切相關(guān)，與不涉及ERS的凋亡信號通路無關(guān)。因此ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是不同于死亡受體及線粒體途徑的一種新的細(xì)胞凋亡途徑。

我們的研究通過構(gòu)建STZ DM大鼠模型，通過檢測DN大鼠相關(guān)生化指標(biāo)及腎臟組織中ERS標(biāo)志分子GRP78及特有的相關(guān)凋亡因子Caspase12的動態(tài)性表達(dá)，來研究DN不同時期腎臟細(xì)胞的應(yīng)激能力及相關(guān)的腎臟細(xì)胞凋亡情況與腎臟病變的程度的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DM組24 h尿蛋白排泄量、血肌酐值較正常對照組明顯增加，同時隨著病程的延長，與DM 6周組比較，DM 12周組24 h尿蛋白排泄量、血肌酐值也相應(yīng)增加;TUNEL法檢測DM組大鼠腎臟細(xì)胞的AI顯著高于對照組，且隨著病程的延長腎臟細(xì)胞的凋亡程度逐漸增加;研究還發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠腎臟組織中，免疫組織化學(xué)和RT-PCR結(jié)果提示，GRP78和Caspase12有少量表達(dá)，主要分布在腎小球細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞，在間質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)，DM組大鼠腎臟組織中GRP78和Caspase12的表達(dá)較正常對照組明顯增高，并隨著病程的延長，GRP78和Caspase12的表達(dá)也相應(yīng)增加，這表明ERS已被啟動，相關(guān)的細(xì)胞凋亡也相應(yīng)出現(xiàn)，且與DM病程相關(guān);同時GRP78蛋白的表達(dá)與腎臟細(xì)胞的凋亡程度、血肌酐水平、24 h尿蛋白量之間均呈正相關(guān)。

本研究結(jié)果提示，GRP78和Caspase12的動態(tài)表達(dá)可能與DN的進(jìn)展密切相關(guān)，提示DM大鼠體內(nèi)腎臟組織中ERS介導(dǎo)的凋亡途徑被激活。同時也提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡與腎臟細(xì)胞的丟失有關(guān)，且隨著病程的延長，腎臟細(xì)胞的凋亡逐漸增加。這也提示了一種通過抑制內(nèi)源性GRP78和Caspase12生成來延緩DN發(fā)展的新思路。DN的發(fā)病機(jī)制是多因素、多途徑的結(jié)果，若早期在ERS環(huán)節(jié)上加以干預(yù)，有可能為延緩DN的發(fā)展提供新的治療途徑。因此，臨床上可以采取相應(yīng)措施，從而在某種程度上抑制腎臟細(xì)胞調(diào)亡，降低DM腎臟損害。

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