新型豬膠原基真皮支架血管化的實(shí)驗(yàn)研究

卞東會，陳銘銳，于仁義，劉本立，宋國棟

(1濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，濟(jì)南250031;2山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院)

特重?zé)齻颊叩木戎芜^程中，及早有效地覆蓋大面積的皮膚缺損區(qū)是救治的重要問題。異體脫細(xì)胞真皮(HADM)在結(jié)構(gòu)和功能上最為接近天然真皮，已在臨床得到廣泛的應(yīng)用，證明其是一種安全和有效的真皮替代材料［1］。但是HADM造價高，供體來源有限，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)困難，還涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的相關(guān)問題，有潛在傳播疾病的風(fēng)險，也限制了它的臨床應(yīng)用。豬皮來源廣泛，價格低廉，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但經(jīng)過動物和臨床試用均表明，傳統(tǒng)方法制備的豬脫細(xì)胞真皮(PADM)臨床應(yīng)用效果不佳，其存在的異種蛋白抗原可能是主要原因［2，3］。另外，理想的真皮替代物首先應(yīng)具備良好的組織相容性，有利于宿主細(xì)胞的長入，這也是其植入體內(nèi)后能迅速血管化的關(guān)鍵。如何降低免疫原性，提高其組織相容性是改良PADM的一個方向。針對目前異種脫細(xì)胞真皮存在的一些缺陷，山東大學(xué)化學(xué)工藝研究所研制出一種新型的豬膠原基真皮支架(PCDM)［4］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過病理切片及掃描電鏡對其組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察;利用四甲基偶氮唑鹽比色法評價其細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)表明PCDM符合植入人體生物材料的細(xì)胞毒性要求。本研究時間為2007年3月～2009年3月，我們將PCDM埋植于Wistar大鼠皮下，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)在支架內(nèi)部的黏附生長特性，以及血管化情況，分析其作為真皮支架的可行性，并提供改良真皮支架的思路，以期為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供良好的生物材料。

1 材料與方法

1.1 動物模型及處理 成年雄性Wistar大鼠24只(山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量300～350 g，隨機(jī)分為兩組，每組12只，分別為HADM組和PCDM組。將大鼠用氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉后，電推備皮，3%碘伏消毒大鼠背部，在脊柱兩側(cè)分別做一個1.5 cm×1.5 cm大小的皮瓣，深及深筋膜。將PCDM(或HADM)分別剪成1.0 cm×1.0 cm大小，在大鼠的一側(cè)埋置移植物后以3-0絲線將其固定于大鼠背部，將創(chuàng)緣皮膚原位縫合固定，無菌敷料包扎。另一側(cè)原位縫合，作為假手術(shù)對照。兩組大鼠單籠飼養(yǎng)。

1.2 HE染色及CD34、Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色在第3天、第7天、第2周、第4周每組分別隨機(jī)取3只大鼠處死，觀察大鼠創(chuàng)面的愈合及埋植的PCDM(或HADM)的變化。分別取出PCDM(或HADM)，進(jìn)行HE染色及CD34、Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色，觀察PCDM(或HADM)細(xì)胞浸潤、膠原生長和血管化情況。

1.3 血管計(jì)數(shù) 不同的時相點(diǎn)取埋植后的PCDM(或HADM)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，于高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)真皮淺層5個視野內(nèi)的典型微血管(管壁較完整且管腔內(nèi)含紅細(xì)胞)數(shù)目，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)使用Fisher's精確概率法，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 制備好的PCDM呈瓷白色，表面平整光滑，有皮膚紋理起伏感，當(dāng)中有均勻分布的天然毛孔，柔韌易塑形(圖1)。術(shù)后創(chuàng)口周圍皮膚無明顯紅腫及炎癥反應(yīng)，1周時創(chuàng)緣基本愈合，2周時創(chuàng)緣完全愈合，4周時幾乎看不清切口。術(shù)后4周手術(shù)區(qū)毛發(fā)生長好，與手術(shù)區(qū)外比較差別不大。術(shù)后14 d各組移植物質(zhì)地稍硬，透過皮膚可以較容易地觸及。切開觀察移植物與周圍組織相容性好，降解不明顯。術(shù)后30 d切開取樣檢視時，可見埋入皮下的真皮移植物表面有豐富而清晰的血管網(wǎng)，移植物與創(chuàng)面接觸緊密。其中部分有不同程度吸收退化，以HADM較明顯，表現(xiàn)為面積縮小，厚度變薄等，個別甚至難以辨認(rèn)。

圖1 PCDM的大體形態(tài)

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 HE染色觀察 術(shù)后3 d各組真皮替代物內(nèi)可見成纖維細(xì)胞(FB)侵入，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及少量巨噬細(xì)胞浸潤。各移植物與周圍組織連接處可見開始增生的細(xì)小新生毛細(xì)血管芽(封三圖2、3)。術(shù)后7 d時，各移植真皮內(nèi)可見新生毛細(xì)血管向移植物內(nèi)部延伸。術(shù)后14 d各組移植物與受床周圍組織界限清楚，組織內(nèi)見VEC增生，新形成的毛細(xì)血管多分布于靠近受床組織處，少數(shù)達(dá)移植物內(nèi)部;組織中可見少量的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(封三圖4、5)。術(shù)后30 d，移植物內(nèi)血管進(jìn)一步成熟，并分布到移植物內(nèi)各處。FB數(shù)目減少，膠原纖維增多，各組真皮與受床的界線仍較清楚，原有網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的清晰可見(封三圖6～8)。未見明顯的炎性細(xì)胞。

2.2.2 免疫組織化學(xué)染色 兔抗鼠CD34及Ⅷ因子分別對VEC胞質(zhì)陽性著色(封三圖9)。PCDM組與HADM組在移植后的血管化進(jìn)程、VEC的增生、遷移和數(shù)量變化上無明顯區(qū)別。

2.2.3 血管化速度 PCDM移植后3 d即有VEC浸潤生長，偶可見血管增生灶，內(nèi)部未見明顯血管增生。7 d時，微血管可達(dá)PCDM真皮淺層，VEC幼稚，管腔小，管壁薄。血管數(shù)量與HADM比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。14 d時，血管已遷入真皮支架內(nèi)部，數(shù)量明顯增多，VEC較成熟，管腔變大，管壁增厚，與7 d時比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。30 d時，血管進(jìn)一步成熟，血管結(jié)構(gòu)完整，管腔大，管壁厚，VEC細(xì)長，但血管數(shù)量未見明顯增多，與14 d時比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各個時相點(diǎn)，兩組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同的時相點(diǎn)毛細(xì)血管計(jì)數(shù)比較(ˉx±s)

3 討論

FB在組織工程皮膚中有著深遠(yuǎn)的意義。有研究表明，膠原凝膠中混合一定量的FB于體外培養(yǎng)可增強(qiáng)該真皮支架的機(jī)械強(qiáng)度及耐酶解作用［5］。而在尼龍網(wǎng)上種植新生兒包皮FB后，可促進(jìn)血管侵入生長，并減少對尼龍、硅膠等異物的炎性反應(yīng)［6］，因此，真皮替代物中快速廣泛的長入FB，可提高生物親和性，加速新生血管形成。但對其具體機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為，F(xiàn)B作為真皮組織中主要的細(xì)胞成分，具有較高的生物學(xué)活性，可分泌多種細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而增強(qiáng)真皮替代物的親和性，促進(jìn)血管化［7］。皮膚全厚缺損的愈合，真皮層和上皮層成分的廣泛合成和改建，其中FB在這種過程中起著重要的作用。因此提高真皮替代物的組織相容性是真皮替代物改良的重要方向。

我們的實(shí)驗(yàn)通過組織學(xué)觀察到，PCDM移植后3 d即有FB、VEC浸潤生長，偶可見血管增生灶，內(nèi)部未見明顯血管增生。7 d時，各移植真皮內(nèi)可見大量FB侵入、增生，沿膠原纖維方向分布，微血管可達(dá)PCDM真皮淺層，VEC幼稚，管腔小，管壁薄。血管數(shù)量與HADM比較未見明顯差異。14 d時，各組移植物與受床周圍組織界限清楚，組織內(nèi)見較多FB浸潤和VEC增生，新形成的毛細(xì)血管多分布于靠近受床組織處，少數(shù)達(dá)移植物內(nèi)部，數(shù)量明顯增多，VEC較成熟，管腔變大，管壁增厚，與7 d時比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30 d時，F(xiàn)B數(shù)目減少，膠原纖維增多，排列規(guī)則，各組真皮與受床的界線仍較清楚，原有網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的清晰可見，血管進(jìn)一步成熟，血管結(jié)構(gòu)完整，管腔大，管壁厚，VEC細(xì)長，但血管數(shù)量未見明顯增多，與14 d時比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各個時相點(diǎn)，HADM、PCDM之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，PCDM可誘導(dǎo)宿主FB及毛細(xì)血管有序長入，并可改造新生的真皮基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，本組PCDM有著良好的組織相容性。

我們以往通過對FB在PCDM真皮乳頭層和真皮網(wǎng)狀層的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)［8］:雖然在細(xì)胞種植早期乳頭層面有利于FB的黏附，但晚期卻成為FB進(jìn)一步增殖并向真皮基質(zhì)深部滲透的障礙，因此保留乳頭層的PCDM植入體內(nèi)，勢必影響其血管化進(jìn)程和宿主細(xì)胞的長入。另外，真皮乳頭層是異種抗原最易殘留的區(qū)域。Desagun等［9］用抗豬ADM抗血清進(jìn)行IHC實(shí)驗(yàn)，ADM內(nèi)的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白不發(fā)生反應(yīng)，而基底層區(qū)域反應(yīng)最強(qiáng)，由此認(rèn)為基底層Ⅳ型膠原或?qū)羽みB蛋白是豬ADM抗原的主要來源。Ninomiya［10］亦指出基底膜Ⅳ型膠原中 α(Ⅳ)NCL結(jié)構(gòu)域有明顯的抗血管生成活性，因此去除基底膜及致密的乳頭層既可以提高PCDM的組織相容性，也能降低抗原性。如果將PCDM用于組織填充或聯(lián)合帶有基底膜的自體刃厚皮移植，完全可以去除乳頭層;若作為組織工程皮的真皮模版體外構(gòu)建復(fù)合皮，去除乳頭層面時要慎重，這樣會降低種子細(xì)胞早期的黏附率，去除真皮乳頭層同時改良工藝，對PCDM表面修飾來提高其早期的細(xì)胞黏附性將是最好的選擇。

ADM的基本結(jié)構(gòu)是膠原網(wǎng)架，膠原分子的三股螺旋結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，不為一般蛋白酶水解，但可為膠原酶水解，膠原的降解較慢，半壽期為數(shù)周至數(shù)年不等。在動物，靜止的真皮結(jié)締組織中沒有膠原酶，但在創(chuàng)傷愈合過程中新形成的間葉組織中則具有膠原酶，通過膠原酶的作用，膠原降解、溶解，后被吸收;FB是組織中膠原酶的主要來源，在結(jié)締組織的分解代謝過程中起關(guān)鍵性作用［11］。另外，膠原還可被新生的VEC溶解。機(jī)體通過膠原合成和膠原降解吸收，對組織進(jìn)行改造［12］。本實(shí)驗(yàn)取材中發(fā)現(xiàn)，ADM移植后4周稍有縮小。鏡下觀察，雖然長入ADM中的FB已產(chǎn)生新膠原纖維，但ADM中原有的膠原網(wǎng)架結(jié)構(gòu)仍非常清晰。我們推測這種吸收可能是正常的組織改建。關(guān)于ADM移植后的降解改建、新生膠原的亞型及其比例是否接近于正常皮膚等問題，尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，PCDM具有較好的組織相容性。人FB、VEC在PCDM上增殖良好，細(xì)胞能夠廣泛遷入支架內(nèi)部，血管化好，雖然遷入的數(shù)量和深度有限，但足以說明不存在異種抗原阻礙人FB向真皮內(nèi)部的滲透，可能是膠原結(jié)構(gòu)方面的缺陷使FB不能大量而廣泛的遷入，提示結(jié)構(gòu)改良有助于提高其細(xì)胞相容性。在細(xì)胞種植的早期，真皮支架的乳頭層較網(wǎng)狀層更有利于FB的黏附，但晚期乳頭層卻成為FB進(jìn)一步增殖并向真皮基質(zhì)深部滲透的障礙，因此去除真皮乳頭層有助于提高異種真皮替代物的組織相容性，但網(wǎng)狀層真皮表面需要進(jìn)一步修飾以提高細(xì)胞早期的黏附率。本實(shí)驗(yàn)是對這種新型PCDM的安全性和組織相容性的初步研究，進(jìn)一步揭示其結(jié)構(gòu)和成分以及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改良和臨床應(yīng)用尚需要多次的體外實(shí)驗(yàn)和動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來協(xié)助完成。

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