基因芯片技術(shù)在常見腸道致病菌感染檢測中的應(yīng)用

戈海澤，梁慧敏，盧晉英，劉樹業(yè)

(1天津市第三中心醫(yī)院，天津300170;2天津醫(yī)科大學(xué))

腸道致病菌是臨床上引起以腹瀉、嘔吐為主要癥狀的首要病因之一，也是危害食品安全的主要因素。近年來由于天然食物源生產(chǎn)的全球化、新食品生產(chǎn)工藝的應(yīng)用、人們飲食習(xí)慣的改變以及衛(wèi)生環(huán)境惡化等各種因素在一定程度上降低了食品的安全性，增加了腸道致病菌感染的幾率［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)報(bào)告，發(fā)達(dá)國家死于食物中毒的兒童中，70.0%是由微生物性食物中毒所致，而腸道致病菌是引起食源性疾病中最常見的生物致病因素之一［2～5］。因此，能夠及時準(zhǔn)確地檢出腹瀉病原菌，對于早期發(fā)現(xiàn)傳染源、控制疾病流行及有效治療腹瀉病患者有非常重要意義。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)是目前細(xì)菌感染的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在著培養(yǎng)周期長，不同的細(xì)菌對營養(yǎng)條件和培養(yǎng)環(huán)境的要求都不相同，很難在同一條件下鑒定出不同種屬的細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)研究時間為2010年10～12日，我們利用細(xì)菌種屬特異性基因、重要毒力基因以及目前已經(jīng)可區(qū)分菌株亞型的基因作為靶基因探針制備基因芯片，檢測常見腸道致病菌，為疾病預(yù)防控制和臨床快速診斷提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 標(biāo)準(zhǔn)菌株選取引起腸道感染的常見腸道致病菌，均為真空冷凍干燥保存的細(xì)菌(來自中國醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心)，按照常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)蘇和形態(tài)學(xué)鑒定，包括金黃色葡萄球菌、志賀菌、副溶血弧菌、大腸埃希菌 O157∶H7、傷寒沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、蠟狀芽孢桿菌、空腸彎曲菌、艱難梭菌。

1.2 主要試劑及儀器 VITEK-Jr全自動微生物鑒定系統(tǒng)，美國安瑪西亞Lucidea Spotter基因芯片點(diǎn)樣儀;MDS公司GENEPIX 4400A基因芯片掃描儀，美國Bio-Rad公司PTC200型PCR擴(kuò)增儀，麥康凱培養(yǎng)基，漢克培基，慶大霉素—亞碲酸鉀平板由天津市金章醫(yī)用新技術(shù)研究所提供;DNA抽提試劑盒、鏈霉親和生物素堿性磷酸酶，PCR試劑盒購自上海普洛麥格公司。

1.3 方法

1.3.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成及基因組DNA擴(kuò)增 從GenBank獲取這些細(xì)菌16S rDNA、23S rDNA序列，利用上述病原菌的特異性基因、重要毒力基因以及目前區(qū)分菌株亞型的基因，設(shè)計(jì)并合成引物，寡核苷酸探針設(shè)計(jì)在每重病原菌基因組兩對引物之間的可變區(qū)，在5'端標(biāo)記氨基基團(tuán)，反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化，Cy3-dUTP標(biāo)記16S rDNA，Cy5-dUTP標(biāo)記23S rDNA;挑取鑒定的單個菌落，研磨、振蕩、混勻于100 μL裂解液震蕩混勻，置沸水浴10 min，再經(jīng)13 000 r/min離心10 min，取上清液作PCR模板，－20℃保存?zhèn)溆?基因組DNA擴(kuò)增應(yīng)用50 μL PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s進(jìn)行40個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后，2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測PCR產(chǎn)物，為使PCR達(dá)到最高的擴(kuò)增效率和靈敏度，對反應(yīng)體系中上、下游引物的用量及比例，反應(yīng)液成分及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 臨床標(biāo)本采集與DNA擴(kuò)增 收集2008～2011年就診于天津市第三中心醫(yī)院腸道科100份腹瀉患者糞便標(biāo)本，平行采集兩份，一份用于基因芯片檢測，另一份用于常規(guī)培養(yǎng)鑒定。

1.3.3 基因芯片的制備和雜交 將制備的探針用點(diǎn)樣液(6×SSC，0.1%SDS)稀釋至終濃度為50 μmol/L，各取6 μL置于384孔板，用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)到醛基化玻片上，每點(diǎn)體積約為0.5 nL，直徑約200 μm，間距500 μm，重復(fù)2 次;同時設(shè)立不含寡核苷酸片段點(diǎn)樣液的空白對照，點(diǎn)樣時保持相對濕度為70%、溫度為25℃。將點(diǎn)樣后的芯片于室溫放置至少20 h。使用時用0.2%的SDS洗去芯片上一些未共價結(jié)合的寡核苷酸，然后用雙蒸水沖掉殘余的SDS，自然晾干，待用。將PCR產(chǎn)物于PCR擴(kuò)增儀上94℃變性5 min，迅速置于0℃的冰上5 min;取變性過的PCR擴(kuò)增液1 μL與9 μL雜交液混勻，將10 μL混合液轉(zhuǎn)移至芯片的雜交區(qū)域。將芯片置于雜交盒中，50℃水浴保溫1 h。將雜交后的芯片依次于室溫下在洗液A(1×SSC，0.2%SDS)、洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗滌1 min。用洗液進(jìn)行洗膜3次后，加入POD作用10 min，然后加入TMB避光顯色5 min。將洗滌完的芯片置于熒光掃描儀中掃描。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增與條件優(yōu)化 分別對引物之間的濃度、模板量、退火溫度和鎂離子濃度進(jìn)行了優(yōu)化。同時，分別對目的基因上、下游引物比例進(jìn)行了優(yōu)化。PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 基因芯片雜交檢測結(jié)果 每株標(biāo)準(zhǔn)菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后與膜芯片進(jìn)行雜交結(jié)果見封三圖1;藍(lán)色斑點(diǎn)僅出現(xiàn)在其對應(yīng)的位置，在其他位置未出現(xiàn)，表明該方法能夠準(zhǔn)確檢測出這些腸道致病菌。

2.3 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果 采用基因芯片技術(shù)與細(xì)菌培養(yǎng)對100份糞便標(biāo)本進(jìn)行平行檢測，基因芯片共檢出50份(50%)攜帶腸道致病菌，其中檢出金黃色葡萄球菌7株、志賀菌7株、副溶血弧菌17株、大腸埃希菌O157∶H72株、傷寒沙門菌2株、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌4株、單核細(xì)胞增生李斯特菌3株、蠟狀芽孢桿菌2株、空腸彎曲菌4株、艱難梭菌2株;細(xì)菌培養(yǎng)鑒定出47份(47%)攜帶腸道致病菌，其中金黃色葡萄球菌8株、志賀菌6株、副溶血弧菌16株、大腸埃希菌O157∶H73株、傷寒沙門菌2株、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌3株、單核細(xì)胞增生李斯特菌2株、蠟狀芽孢桿菌2株、空腸彎曲菌3株、艱難梭菌2株，其中42例基因芯片檢測與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為79.25%，兩種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.28，P ＞0.05)。

3 討論

基因芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)平臺，以其快速、準(zhǔn)確、高通量、自動化等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域，如細(xì)菌分子流行病學(xué)調(diào)查、細(xì)菌基因鑒定、基因突變及多態(tài)性分析、基因表達(dá)譜分析、DNA 測序等［6～8］。不同腸道致病菌感染的主要臨床癥狀均是惡心、嘔吐和腹瀉，臨床癥狀難以區(qū)分各種腸道致病菌，因此，鑒定腸道致病菌主要依賴臨床實(shí)驗(yàn)室檢測。盡管細(xì)菌培養(yǎng)是病原菌診斷鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但是在相同條件下很難同時培養(yǎng)多種腸道致病菌，而且培養(yǎng)至少需要3～5 d才能確定致病菌類型，不僅耗時而且很難實(shí)現(xiàn)高通量平行檢測多種腸道致病菌［9～11］。本研究依據(jù)細(xì)菌DNA生物信息學(xué)信息，以基因芯片為技術(shù)平臺，成功實(shí)現(xiàn)了對細(xì)菌樣本及臨床標(biāo)本的預(yù)處理、PCR擴(kuò)增和基因芯片雜交等研究。我們針對細(xì)菌16S rDNA、23S rDNA序列建立的基因芯片檢測系統(tǒng)，可以快速準(zhǔn)確地鑒定臨床常見的十余種腸道致病菌，整個檢測過程只需要2～3 h，較傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測技術(shù)明顯縮短了檢測時間，對于癥狀危急的感染者，可以做到及早診斷、對癥用藥。

基因芯片技術(shù)的特異性是本方法的關(guān)鍵，與所選取的靶基因和篩選的引物、探針密切相關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)所檢測靶細(xì)菌中有很多屬于同一種屬內(nèi)細(xì)菌，具有相近的遺傳關(guān)系，因此在選擇靶基因時需要嚴(yán)格篩選，要求相對應(yīng)的引物與探針具有很高的特異性［12］。經(jīng)過對PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以及大量寡核苷酸探針的篩選，我們將實(shí)驗(yàn)中的探針和引物在GenBank進(jìn)行BLAST比對，每條引物和探針序列均具有很高的特異性，保證了檢測方法的可靠性?；蛐酒瑱z測的靈敏度也是該鑒定方法的重要評價指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)所建立的基因芯片檢測技術(shù)對于每種靶細(xì)菌的靈敏度均可以達(dá)到103CFU/mL，而實(shí)驗(yàn)中的PCR電泳檢測的靈敏度只有達(dá)到105CFU/mL，明顯低于基因芯片技術(shù)，與目前報(bào)道的其他一些基因芯片檢測方法的靈敏度一致［13，14］。我們采用基因芯片技術(shù)與細(xì)菌培養(yǎng)對100份糞便標(biāo)本進(jìn)行平行檢測，兩種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種檢測方法的差異可能與以下幾方面原因有關(guān):①基因芯片檢測是在PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，死亡或破碎的細(xì)菌也同樣可以擴(kuò)增;②細(xì)菌數(shù)量不足103CFU/mL，并含有較多的雜菌;③革蘭陽性細(xì)菌破壁較難，基因組DNA沒有完全釋放出來，所以PCR擴(kuò)增會產(chǎn)生陰性結(jié)果;④細(xì)菌培養(yǎng)需要在很多雜菌中挑選出致病菌的克隆，在細(xì)菌量少的情況下就很難進(jìn)行分離純化［14，15］。

臨床腹瀉患者的快速檢測與診斷是目前研究的一個熱點(diǎn)，隨著基因芯片技術(shù)應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，使其快速、高通量檢測得以實(shí)現(xiàn)。針對目前腸道致病菌基因芯片檢測的現(xiàn)狀與不足，后續(xù)研究還需要在臨床樣本的基因組DNA提取方面做一些實(shí)驗(yàn)，以便使對于臨床樣本的處理更科學(xué)、合理、有效。我們下一步將增加探針的數(shù)目，爭取涵蓋更多的病原菌，不斷擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)菌株的檢測范圍，并進(jìn)一步評價芯片系統(tǒng)的特異性和敏感性。雖然目前基因芯片技術(shù)成本昂貴，檢測的可靠性、實(shí)用性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證，但基因芯片技術(shù)快速、高通量等優(yōu)勢將為腸道致病菌的復(fù)雜、多樣性提供更為廣闊的應(yīng)用前景。

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