利用纖維素水解液中的纖維二糖發(fā)酵制備丁二酸

徐 蓉，奚永蘭，張九花，戴文宇，萬(wàn)月佳，陳可泉，姜 岷

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

丁二酸又名琥珀酸，是一種重要的碳四平臺(tái)化合物，其作為一種重要的化工原料在醫(yī)藥、食品以及表面活性劑等行業(yè)有著廣泛的用途。傳統(tǒng)的丁二酸生產(chǎn)方法以不可再生的石油資源為原料帶來(lái)了高成本、高污染等問(wèn)題，限制了琥珀酸作為基本化工原料的廣泛應(yīng)用。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸具有利用可再生資源、固定溫室氣體CO2等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，并在菌種選育和發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面取得了重要的進(jìn)展[1-3]。

目前研究的丁二酸生產(chǎn)菌株主要集中在產(chǎn)琥珀酸放線 桿菌（Actinobacillus succinogenes）[4-5]、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（ Anaerobiospirillum succiniproducens ）[6-7]、 產(chǎn) 琥 珀 酸 曼 式 桿 菌（Mannheimia succiniciproducens）[8]、重組大腸桿菌（Escherichia coli）[9]。其中，產(chǎn)琥珀酸防線桿菌是一種從瘤胃中分離、耐滲透壓的兼性厭氧細(xì)菌，這種細(xì)菌可以高產(chǎn)琥珀酸，而且它可以在厭氧條件下利用和同化多種糖類，如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、纖維二糖和甘露醇等[10]。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的這一特點(diǎn)，使它能夠利用各種各樣的糖類作為碳源高效生產(chǎn)丁二酸。據(jù)報(bào)道，一些廢棄的廉價(jià)可再生纖維素資源如秸稈[11]、玉米皮[12]、甘蔗渣[13]等經(jīng)過(guò)處理后得到的水解液可作為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌生產(chǎn)丁二酸的原料，而這些水解液中往往含有多種糖類，如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、纖維二糖等，但是很少有研究者去考察產(chǎn)琥珀酸防線桿菌利用二糖生產(chǎn)丁二酸的情況，以及水解液中二糖的存在對(duì)菌體利用其它單糖的影響。

纖維素水解液中通常含有纖維二糖，這是一種還原性的二糖，是纖維素的基本組成單位。本文考察了Actinobacillus succinogenes NJ113 利用纖維二糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的能力，并利用纖維素酶酶解甘蔗渣纖維素制備纖維二糖的水解糖液，從而用于考察以纖維二糖為主要糖分的水解糖液作為碳源對(duì)菌體發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 原料

甘蔗渣由廣州甘蔗糖業(yè)研究所提供。

1.2 生產(chǎn)菌株

Actinobacillus succinogenes NJ113（本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖10 g/L （分開(kāi)滅菌），酵母膏5 g/L，玉米漿干粉 2.5 g/L，NaHCO310 g/L，NaH2PO4·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4·3H2O 15.5 g/L，NaCl 1 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

糖類30～70 g/L（分開(kāi)滅菌），酵母膏10 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L ，乙酸鈉1.36 g/L，K2HPO43 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.2 g/L，NaH2PO4·2H2O 1.6 g/L，Na2HPO4·3H2O 0.31 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.4 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將凍存于-70℃冰箱的菌種接種于100 mL 血清瓶培養(yǎng)，裝液量50 mL，接種量3%，于37 ℃、200 r/min 搖床中培養(yǎng)10 h 后作為種子液。

血清瓶培養(yǎng)：100 mL 血清瓶裝液量30 mL，接種量3%，于37 ℃、200 r/min 搖床中培養(yǎng)。

3 L 發(fā)酵罐（BioFlo 110 fermentor；New Brunswick Scientific Co.，Edison，N.J.）培養(yǎng)：裝液量1.5 L，接種量6%（體積分?jǐn)?shù)），在37 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、CO2通氣量0.5 L/min、以25%NaCO3為pH 調(diào)節(jié)劑維持pH 值在6.8。

1.5 制備含大量纖維二糖的纖維素水解液

將一定量的甘蔗渣洗凈、烘干，粉碎后過(guò)40目篩，然后用2%稀硫酸121 ℃下酸解2 h，過(guò)濾去除液體，洗滌殘?jiān)?，殘?jiān)闹饕煞旨礊槲茨芩峤獾恼嵩械睦w維素。將殘?jiān)糜? L 大三角瓶中，加入一定量的水控制固液比為1∶5，pH 值調(diào)至5.0，添加液體纖維素酶Celluclast 1.5 L（丹麥諾維信公司）15 U/mg，在50 ℃、150 r/min 下振蕩酶解72 h后，過(guò)濾去除殘余固體得水解糖液。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體密度的測(cè)定

將發(fā)酵液用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使A660值在0.2～0.8 之間，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Spectrumlab 752s）測(cè)定。菌液濁度OD660=A660×稀釋倍數(shù)。

1.6.2 糖類及有機(jī)酸含量的測(cè)定

蔗渣纖維素水解液中各種糖含量的測(cè)定、發(fā)酵液中殘?zhí)呛陀袡C(jī)酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜柱為Aminex HPX-87H 型離子排斥色譜柱（300 mm ×Φ7.8 mm，5 μm），以 0.005 mol/L of H2SO4作為流動(dòng)相，流速0.6 mL/min-1，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫55 ℃。纖維二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等利用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)[14]，丁二酸、乙酸等利用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維二糖與纖維素水解液中其它常見(jiàn)碳源發(fā)酵情況的比較

纖維素水解液中含有多種糖類，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖等。本實(shí)驗(yàn)在100 mL 的血清瓶中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，分別考察不同碳源（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖）對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響，設(shè)定初始糖濃度為30 g/L，發(fā)酵24 h，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 纖維素水解液中常見(jiàn)糖類作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的結(jié)果

由圖1可以看出，對(duì)于這4種碳源，Actinobacillus succinogenes NJ113 都有較強(qiáng)的利用能力，丁二酸的產(chǎn)率均達(dá)到60%以上。木糖和阿拉伯糖作為碳源時(shí)，丁二酸產(chǎn)量分別為18.1 g/L 和19.1 g/L；當(dāng)葡萄糖和纖維二糖作為碳源時(shí)，丁二酸產(chǎn)量分別達(dá)到20.49 g/L 和20.67 g/L，明顯優(yōu)于其它兩種碳源。進(jìn)行至發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖均完全消耗，但纖維二糖還有少量殘余，而且當(dāng)纖維二糖作為碳源時(shí)，發(fā)酵液中的乙酸量較高，丁二酸與乙酸的摩爾比為0.98，而葡萄糖、木糖和阿拉伯糖作為碳源發(fā)酵時(shí)，丁二酸與乙酸的摩爾比分別為1.19、1.14和1.07。由此可見(jiàn)，纖維二糖可以作為碳源用于丁二酸的生產(chǎn)，但存在一些不足，如菌體不能將碳源完全消耗，且副產(chǎn)物乙酸的量較高。

以前的研究發(fā)現(xiàn)，A.succinogenes 利用激酶途徑和PEP-PTS 攝入葡萄糖，而且PEP-PTS 還負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)果糖、甘露糖、山梨醇、β-葡萄糖苷（如纖維二糖、熊果苷）等[3，15-16]。細(xì)胞外的碳源進(jìn)入PTS 的糖轉(zhuǎn)運(yùn)通道后被磷酸化，與此同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的一部分磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，這導(dǎo)致了C4途徑通量的減少，而C3 途徑的通量增加，進(jìn)而導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的增多。因此，在纖維二糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸時(shí)，可能由于PTS 發(fā)揮作用，導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的量較多，究其原因還需要進(jìn)一步研究。

2.2 不同濃度的纖維二糖作為碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)丁二酸的影響

本實(shí)驗(yàn)在100 mL 的血清瓶中進(jìn)行厭氧發(fā)酵36 h，分別考察不同濃度的纖維二糖（30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L）作為碳源時(shí)對(duì)菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)丁二酸的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1 可以看出，當(dāng)纖維二糖濃度為30 g/L 時(shí)，纖維二糖的利用率為95.5%，丁二酸的產(chǎn)率高達(dá)72.15%，可見(jiàn)產(chǎn)琥珀酸防線桿菌NJ113 有很強(qiáng)的利用纖維二糖發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的能力；但隨著纖維二糖濃度的繼續(xù)增大，殘?zhí)橇坎粩嘣龆啵琌D 值呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；產(chǎn)物丁二酸的濃度也隨著纖維二糖的增加而增多，但產(chǎn)率卻有所降低。當(dāng)糖濃度為70 g/L 時(shí)，糖利用率僅為83.4%，丁二酸濃度為38.91 g/L，產(chǎn)率為66.65%，較30 g/L 時(shí)降低了7.6%，此時(shí)的收率只有55.59%。由此可知，高濃度的纖維二糖對(duì)于菌體生長(zhǎng)有一定的抑制，從而導(dǎo)致丁二酸的產(chǎn)量和收率也有明顯的降低。

表1 不同濃度的纖維二糖作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的結(jié)果

2.3 纖維二糖作為碳源發(fā)酵制備丁二酸

在3 L 發(fā)酵罐中考察以纖維二糖作為碳源發(fā)酵制備丁二酸的情況。設(shè)定初始纖維二糖濃度為35 g/L，厭氧發(fā)酵30 h，發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2 可以看出，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至4 h 時(shí)，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，開(kāi)始大量消耗纖維二糖，發(fā)酵至26 h 時(shí)，培養(yǎng)基中的纖維二糖被完全消耗，總的耗糖速率達(dá)到1.35 g/h/L，此時(shí)丁二酸的濃度為23.51 g/L，產(chǎn)率為67.17%。由此可見(jiàn)，當(dāng)纖維二糖作為碳源用于產(chǎn)琥珀酸放線桿菌生產(chǎn)丁二酸時(shí)，可以獲得較高的丁二酸產(chǎn)率。另外，從發(fā)酵結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，利用纖維二糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸時(shí)，副產(chǎn)物乙酸的量較高，由圖2 可以看出，發(fā)酵至終點(diǎn)時(shí)，副產(chǎn)物乙酸的量為12.44 g/L，丁二酸與乙酸的濃度比為1.89，乙酸產(chǎn)量高的原因還需要進(jìn)一步考察。

圖2 纖維二糖作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的結(jié)果

2.4 蔗渣纖維素水解液作為碳源發(fā)酵制備丁二酸

在3 L 發(fā)酵罐中考察以甘蔗渣纖維素水解液作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的情況。設(shè)定初始糖濃度為35 g/L，其中18 g/L 纖維二糖、8 g/L 葡萄糖、5 g/L 阿拉伯糖、4 g/L 木糖，發(fā)酵33 h，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3 可以看出，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至9 h 時(shí)，菌體密度（OD660）達(dá)到最大值9.73，此時(shí)培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖全部被消耗，葡萄糖的消耗速率明顯大于木糖的消耗速率，而此時(shí)菌體消耗的纖維二糖的量只有2.34 g/L。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至16 h 時(shí)，阿拉伯糖也被全部消耗，此時(shí)發(fā)酵液中的所有單糖成分已均被菌體利用。從發(fā)酵9 h 至24 h，發(fā)酵液中纖維二糖的量快速減少，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至33 h 時(shí)，剩余4.10 g/L 纖維二糖，丁二酸濃度為20.00 g/L，乙酸13.27 g/L，丁二酸產(chǎn)率64.73%。由此可見(jiàn)，菌體優(yōu)先利用單糖，且單糖的消耗速率明顯高于纖維二糖的消耗速率。但菌體并非是先將單糖消耗完全后再開(kāi)始利用纖維二糖，而是二糖的利用要比單糖的利用滯后。另外，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)還有纖維二糖殘留，菌體無(wú)法將纖維二糖完全利用，這可能是由于從發(fā)酵21 h 開(kāi)始，菌體進(jìn)入衰亡期，導(dǎo)致菌體無(wú)法繼續(xù)利用纖維二糖生產(chǎn)丁二酸。

3 結(jié) 論

本文考察了A.succinogenes NJ113 利用纖維二糖發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的能力，并利用甘蔗渣中的纖維素制備纖維二糖用于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在3 L 發(fā)酵罐中，以35 g/L 纖維二糖作為碳源，發(fā)酵33 h，丁二酸的濃度達(dá)到23.51 g/L，丁二酸產(chǎn)率為67.17%；在3 L 發(fā)酵罐中，以蔗渣纖維素水解液作為碳源發(fā)酵，初糖濃度為35 g/L（其中纖維二糖18 g/L），發(fā)酵33 h，丁二酸產(chǎn)率達(dá)到64.73%。因此，A.succinogenes NJ113 有較強(qiáng)的利用纖維二糖的能力，纖維素水解液中的纖維二糖可作為碳源發(fā)酵制備丁二酸。

圖3 蔗渣纖維素水解液作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的結(jié)果

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