青蒿中黃酮、多酚和VC含量測定及抗氧化性研究

（忻州師范學院生化分析技術研究所，山西忻州 034000）

自由基與人的病理、生理有密切關系，大多數自由基氧化性很強，在生理和生物化學中，極少量自由基就可對人身體健康造成很大的損害[1-5]。研究表明，含氧自由基關系到多種疾病，如O2-·自由基可使細胞質和細胞核中的核酸鏈斷裂，會導致腫瘤、炎癥、血液病及心肝、肺、皮膚等方面病變的產生；HO·是化學性質最活潑的活性氧物種，能與糖、蛋白質、DNA、堿基磷脂和有機酸等反應，導致身體組織損害和機體退化，引發(fā)疲勞、延遲性肌肉酸痛、運動性貧血和血紅蛋白尿等，同時也引發(fā)皮膚形成色斑、皺紋以及其他皮膚病變。因此，近年來自由基與人體健康關系的研究已經越來越多，成為備受關注的新領域[6-9]。

青蒿（學名黃花蒿）是一年生草本植物，為菊科艾屬植物。青蒿葉中含有多種生物活性成分，除抗瘧疾特效作用的青蒿素外，還含黃酮、多酚、維生素、氨基酸和各種微量元素[10]?，F代科學分析證明：黃酮類化合物有重要的生理活性：能夠清除體內自由基、具有抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂等藥用保健功效，是我國古代藏醫(yī)、蒙醫(yī)用來治病的常用藥；多酚也是青蒿中的重要活性成分之一，有關醫(yī)學研究報告證實茶多酚具有如下保健治療效果：護肝養(yǎng)胃、清咽潤喉、清除異味、緩解香煙毒害作用；維生素C具有特殊的生物活性和生理特性，如延緩衰老、輔助改善貧血、降壓降脂、促進鈣質吸收，防止便秘、防癌抗癌。大多數資料是研究干青蒿對自由基清除能力，而本文分別用DPPH·法、水楊酸法和鄰苯三酚法對干、鮮青蒿葉總自由基清除能力進行了對比研究，研究結果為保健醫(yī)學、食品營養(yǎng)學等方面提供了重要的實驗參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

無水乙醇、95%乙醇（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；過氧化氫（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；12 mol/L的鹽酸（分析純）：鄭州市滎陽新華化工廠；硫酸亞鐵（分析純）：江蘇金壇縣試劑廠；濃硫酸（分析純）：北京化工廠；抗壞血酸（分析純）：北京化工廠；鄰苯三酚（分析純）、焦性沒食子酸（化學純）：貴州遵義市第二化工廠；DPPH·（化學純）：東京化成工業(yè)株式會社；槲皮素（生化試劑）：上海恒信化學試劑有限公司；實驗用水均為二次蒸餾水。

鮮青蒿葉于2009年7月采集于山西省忻州市。

1.2 儀器

722型光柵可見分光光度計：上海分析儀器總廠；UV-2500紫外可見分光光度計：日本島津公司；精密電子分析天平（AB204-N）：上海梅特斯-托利多儀器有限公司；數控超聲波清洗器（KQ-100DB）：昆山市超聲儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱：天津市三水科學儀器有限公司；真空干燥箱（DZ-1A）：天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3tc精密數顯酸度計：上海天達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波法提取鮮青蒿葉中黃酮、VC及多酚

精確稱取搗碎的鮮或干青蒿葉3.0 g，加入體積分數50%的乙醇溶液，在37℃水浴中超聲提取30min，然后抽濾，將濾液轉移到100 mL的容量瓶中，用95%乙醇定容備用。再取上述溶液1 mL于10 mL的比色管中，加入一定體積其他試劑，定容到刻度，測吸光度。

1.3.2 槲皮素-硝酸鋁乙醇法[9]測定黃酮及工作曲線

分別吸取 100 μg/mL 槲皮素標準液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL 于 10 mL 比色管中，加入1 mL 5%硝酸鋁乙醇溶液，用95%乙醇定容至刻度。搖勻，靜置15 min，以蒸餾水做空白，在最大吸收波長428 nm處測吸光度值。以吸光度值A為縱坐標，濃度C（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。求得回歸方程為：A=0.059 91C-0.020 12（R2=0.998）。

1.3.3 酒石酸亞鐵法測定多酚及工作曲線繪制

分別吸取 1mg/mL 沒食子酸 0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5 mL 于 25 mL 比色管中，各補水4.0 mL然后各加入酒石酸亞鐵5.0 mL，用緩沖溶液定容至25 mL。搖勻，靜置1 h。在最大吸收波長為549 nm處以試劑空白做參比，測其吸光度值；并以吸光度值A為縱坐標,濃度C（μg/mL）為橫坐標繪出標準曲線，得回歸方程為 A=0.017 35C+0.016 29（R2=0.999）。

1.3.4 硫酸-鉬酸銨法測定VC及工作曲線

分別吸取 100 μg/mL VC標準液 1.25、2.5、3.75、5.0、6.25、7.5 mL于25 mL比色管中，每只比色管中各加入2.5 mL 10%硫酸和5.0 mL 10%鉬酸銨溶液，用二次水定容至刻度，搖勻，在沸水中煮沸6 min，稍冷卻后，在最大吸收波長721 nm處,以試劑空白做參比測其吸光度值，以吸光度值A為縱坐標,濃度C（μg/mL）為橫坐標繪出標準曲線，得回歸方程為A=0.101 45C+0.174 67（R2=0.996）。

1.3.5 樣品中活性物質含量的測定

分別移取一定體積稀釋一定倍數的提取液，按照上述實驗方法，測其吸光度值，代入回歸方程，黃酮、多酚、VC的產率按下式計算：

1.3.6 抗氧化能力的測定[1，6]

1.3.6.1 水揚酸法

清除率的測定：在10 mL比色管中依次加入7.5×10-3moL/L的硫酸亞鐵銨 1 mL、再加入1 mL 7.5×10-3moL/L的水楊酸，0.3%的H2O21 mL后，再分別加入提取液 0.5、1、2 mL，反應 20 min后，用二次水定容至10 mL，靜置30 min后，用只加硫酸亞鐵銨、過氧化氫且定容至10 mL的溶液作參比，靜置半小時，測其在510 nm處的吸光度值。

式中：A參比為僅加入 Fe2+、H2O2時的吸光度；A對照為加入Fe2+、H2O2及水楊酸后的羥自由基體系的吸光度；A樣參為加入Fe2+、H2O2及不同提取液后的吸光度；A樣品為加入Fe2+、H2O2及不同提取液、水楊酸后的羥自由基體系的吸光度。

1.3.6.2 DPPH·法

清除率的測定：分別取提取液2.0 mL及2 mL 2×10-4moL/L的DPPH·溶液加入同一10 mL的比色管中，搖勻，30 min后用試劑空白作參比，測定吸光度A樣品，同時用無水乙醇作參比，測定2 mL 2×10-4moL/L DPPH·液與2 mL無水乙醇混合溶液的吸光度A對照，根據下面的公式計算自由基清除率：

式中：A參比為加入無水乙醇時的吸光度值；A對照為加入DPPH·的自由基體系的吸光度值；A樣參為加入不同提取液后的吸光度值；A樣品為加入不同提取液、DPPH·后自由基體系的吸光度值。

1.3.6.3 鄰苯三酚法

抑制率的測定：在4支10 mL比色管中加入2 mL pH=8.43的緩沖溶液，在其中3支比色管中加入0.5、1、2.0 mL的提取液，再往4支分別加入1 mL 0.2×10-3moL/L鄰苯三酚，用水定容至刻度，在吸收波長為322 nm處，每隔30 s記錄一次吸光度，測量時間4 min，其抑制率計算公式為：

2 結果與討論

2.1 青蒿葉中黃酮、多酚和VC含量的測定

按照實驗方法1.3.2、1.3.3、1.3.4，對比測定了鮮青蒿葉和干青蒿葉中黃酮、多酚和VC的含量，結果見表1。

表1 青蒿中黃酮、多酚、VC的含量Table 1 The flavone，polyphenol and vitamin C content in the fresh leaves of arteminsia annua L. mg/g

由表1可知：鮮青蒿葉中各成分的含量：VC>黃酮>多酚；干青蒿葉中各成分的含量：VC>多酚>黃酮；且干青蒿葉中所含各成分的含量顯著高于鮮青蒿葉所含各成分的含量。

2.2 鮮青蒿葉、干青蒿葉提取液的抗氧化能力比較

按實驗方法1.3.6.1、1.3.6.2、1.3.6.3分別測定了鮮青蒿葉、干青蒿葉提取液的抗氧化能力，結果見表2、表3。

表2 不同體積鮮青蒿提取液抗氧化性比較Table 2 Comparison of antioxidant capacities of different extraction volume from fresh leaves of Artemisia annua L.

表3 干青蒿提取液抗氧化性比較Table 3 Comparison of antioxidant capacities of different extraction volume from dry leaves of Artemisia annua L.

由表2、表3可知：鮮或干青蒿葉提取液對DPPH·和OH·的清除率及對O2-·的清除率隨提取液體積增大，即活性成分黃酮、多酚、VC含量越高，自由基清除能力越強，二者呈一定的量效關系。對比加入相同鮮或干青蒿葉提取液（0.5、1、2 mL）時，干青蒿葉提取液對各種自由基清除率總是高于鮮青蒿葉，差距很大。在相同提取液體積時（如1 mL提取液），不同方法測得的鮮青蒿葉提取液抗氧化能力表現為：OH·的清除率>O2-·的清除率>總自由基清除率（DPPH·法）；干青蒿葉提取液抗氧化能力表現為（如1 mL提取液）：總自由基清除率（DPPH·法）>O2-·的清除率>OH·的清除率；上述結果說明，青蒿葉在貯藏過程中，活性成分有所變化，進而對其抗氧化能力有較大的影響。

青蒿廣布于我國全國大部分地區(qū)，本文探討了干鮮青蒿葉中活性成分黃酮、多酚和VC對超氧自由基、羥基自由基和總自由基的清除作用，對尋找天然植物食品抗氧化劑、人體健康所需高效自由基清除劑具有非常重要的價值。青蒿提取物作為天然抗氧化劑，使用安全、具有廣闊的應用前景。

[1] 陳金娥,豐慧君,張海容.紅茶、綠茶、烏龍茶活性成分抗氧化性研究[J] .食品科學,2009,30(3):62-66

[2] 葉杰,陳躬瑞,倪莉.福建黃酒抗氧化活性的研究[J] .中國食品學報,2006,6(1):345-349

[3] 何戰(zhàn)勝,曹朝輝,鄧健.甲苯胺藍光度法測定Fenton反應產生的羥自由基[J] .中國衛(wèi)生檢驗雜志,2005,15(2):160-173

[4] 許申鴻,杭瑚.用DPPH·分析法研究野生植物的抗氧化活性[D] .山東:青島大學學報,1999,12(3):75-78

[5] 韓強,林惠芬,朱玲莉.一些天然提取物對超氧自由基和羥自由基得清除作用[J] .日用化學工業(yè),2000(3):14-17

[6] 趙二勞,張海容,蓋青青,等.沙棘黃銅的測定及其抗氧化作用[J] .化學研究與應用,2003,15(2):284-285

[7] 張海容.修飾多糖的抗氧自由基活性及其與DNA結合機理的熒光法研究[D] .廣州,華南理工大學,2003：53-60

[8] 陳金娥,高虹.不同品種黃酒中多酚含量及抗氧化性研究[J] .釀酒科技,2008(4):37-41

[9] 趙繼紅,梁宇,顏達予.黃酮類化合物抗氧化性的結構因素[J] .北京工業(yè)大學學報,2001,13(1):36-43

[10] 耿颯,葉和春,李和鳳,等.中藥青蒿的生理生化特征及其研究發(fā)展[J] .應用與環(huán)境生物學報,2002,8(1):90-97