• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘蔗黃葉病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測體系研究

    2013-07-26 13:53:02王洪星張雨良王健華劉志昕
    中國糖料 2013年1期
    關(guān)鍵詞:拷貝黃葉甘蔗

    王洪星,龔 殿,張雨良,王健華,劉志昕

    (中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,海南 ???71101)

    甘蔗黃葉?。ㄔ缙诜Q甘蔗黃葉綜合癥)于20世紀(jì)80年代末首先報(bào)道在美國夏威夷發(fā)生,90年代初在巴西造成嚴(yán)重危害,目前幾乎已擴(kuò)散至世界各產(chǎn)蔗國。該病的癥狀常出現(xiàn)在植株生長的中后期,在干旱條件下癥狀表現(xiàn)早而明顯,造成感病品種嚴(yán)重減產(chǎn)[1-3]。其病原ScYLV屬于黃癥病毒科(Luteroviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus),病毒粒體球形,直徑22~24 nm,在寄主體內(nèi)含量很低,僅分布于韌皮部篩管伴胞細(xì)胞質(zhì)中。Lockhart[4]首先利用電子顯微鏡在感病植株葉片韌皮部伴胞細(xì)胞質(zhì)中觀察到多面體ScYLV粒體;隨后利用抗血清技術(shù)檢測該病毒;Schenck[5]利用組織印跡雜交免疫法(TBIA)檢測ScYLV;Comstock[6]采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定方法(DAS-ELISA)進(jìn)行病原檢測。王伯輝等[7]在廣西觀察到甘蔗黃葉病并對其病原進(jìn)行了初步的檢測,許東林等[8]報(bào)道了發(fā)生在廣東蔗區(qū)的ScYLV分子鑒定結(jié)果。與目前使用的生物學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR等ScYLV檢測技術(shù)相比,實(shí)時熒光PCR技術(shù)不但靈敏度高于傳統(tǒng)PCR,而且能對病原體的數(shù)量進(jìn)行精確定量。SYBR Green I染料法具有靈敏度高、信噪比高、適用范圍廣和低價(jià)等特點(diǎn)。在核酸的實(shí)時檢測方面有很多優(yōu)點(diǎn),由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合,不必因?yàn)槟0宀煌貏e定制,因此設(shè)計(jì)的程序通用性好,且價(jià)格相對較低,可提高ScYLV的檢測效果。我們進(jìn)行了ScYLV的實(shí)時熒光RT-PCR檢測技術(shù)研究,以期建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏和簡便的檢測ScYLV的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料為經(jīng)檢測感染了甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒的植株,甘蔗感病材料采自海南省紅毛鎮(zhèn)甘蔗種植基地。

    主要試劑和儀器:Mx3005型熒光定量 PCR儀、TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒、RT-PCR試劑盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0購自寶生物工程(大連)有限公司,Taq酶及其它生物試劑均購自北京全式金生物科技有限公司,其它藥品為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 總核酸的提取 從待檢測甘蔗植株上取幼嫩組織,以TRIzol法[9]提取RNA樣品。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 選取在GenBank上 (登錄號AF369923.1、AF369924.1、AF369925.1、AF369926.1、AF369927.1、AF369928.1、AF369929.1、AF141385.1、AF141385.1)登錄的 9 個 ScYLV 分離物高度保守的衣殼蛋白基因序列中,運(yùn)用Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進(jìn)行基因同源性分析和引物設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成[10]。

    1.2.3 RT-PCR 以所提取病樣的總RNA為模板,以oligodT為反轉(zhuǎn)錄引物,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μL,反應(yīng)成分包括ScYLV CDNA2μL、10 pm/μL 上游引物 s-pf 1μL、10pm/μL 下游引物 s-pr1μL,10mM dNTP2 μL、Taq 酶 0.2μL、無菌水18.8μL。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min,95℃變性30 s,53℃退火1 min,72℃延伸1 min,循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min。取10μL PCR產(chǎn)物與lμL染料相混合,在室溫下進(jìn)行1.2%瓊脂糖恒壓凝膠電泳。PCR產(chǎn)物利用純化試劑盒進(jìn)行切膠純化。

    表1 用于實(shí)時定量PCR擴(kuò)增的引物特征

    1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選、鑒定與稀釋 按照PMD19-T-Vector試劑盒的操作說明將PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體進(jìn)行連接,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-CD201感受態(tài)細(xì)胞。從已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞中提取重組質(zhì)粒,操作按照Axygen公司的質(zhì)粒小量抽提試劑盒進(jìn)行,用菌液PCR法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定;將鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。同時用紫外分光光度計(jì)測定其濃度為1.16 μg/μL,按照公式CN=M×N/L×D計(jì)算其拷貝數(shù)。CN為質(zhì)??截悢?shù),M為檢測到的核酸最小濃度,N為Avgadro's number(6.022×l023molecules/mol);L為核酸長度(質(zhì)??傞L+插入目的片段長度,單位為kb),D為從1kb核酸轉(zhuǎn)化到道爾頓轉(zhuǎn)化因子(dsDNA=6.6×l05)。經(jīng)計(jì)算,得質(zhì)粒的拷貝數(shù)為6.0×109拷貝/μL。加入滅菌水以10倍為梯度將重組質(zhì)粒依次稀釋,放入-20℃冰箱備用。

    1.2.5 引物濃度的優(yōu)化和退火溫度的優(yōu)化 以200nM、400nM、600nM、800nM四個引物濃度梯度進(jìn)行篩選;然后以優(yōu)化的引物濃度,以6×109拷貝/μL到6×102拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板,選取56℃到62℃的10個不同退火溫度進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng),每個梯度設(shè)置兩個重復(fù),觀察不同梯度引物濃度、不同退火溫度對熒光信號的影響。同時在最優(yōu)的反應(yīng)體系和條件下反應(yīng),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.6 特異性測試與重復(fù)性測試 選取感染高粱花葉病毒植株樣品和健康植株樣品的總核酸與ScYLV總核酸,在相同體系和條件下進(jìn)行擴(kuò)增,觀察熒光信號的變化;同時通過批內(nèi)和批間重復(fù)性測試,驗(yàn)證檢測體系的穩(wěn)定性。批內(nèi)重復(fù)性測試是通過對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定3次,批間重復(fù)性測試是連續(xù)3d對同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,通過測得的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)而計(jì)算CV值。

    1.2.7 線性范圍測試 以100倍梯度稀釋的6×108拷貝/μL到6×101拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板,在上述優(yōu)化的體系進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng),通過觀察熒光信號的變化和r2值的大小,確定該體系的線性范圍。

    1.2.8 靈敏性測試的對比試驗(yàn) 分別對己知濃度的ScYLV標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋,以此為模板分別進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)和普通PCR反應(yīng),驗(yàn)證所建立的檢測方法的靈敏性。

    1.2.9 田間樣品檢測 利用已建立的方法對來自田間的13份疑似樣品進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的片段擴(kuò)增

    利用RT-PCR法擴(kuò)增獲得的ScYLV CP基因的插入用目的片段,特異性PCR產(chǎn)物片段長度與預(yù)計(jì)目的片段大小基本一致(圖1)。

    圖1 RT-PCR法擴(kuò)增ScYLVCP基因的插入用目的片段

    2.2 ScYLV目的基因重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

    鑒定結(jié)果如圖2:獲得目的片段與預(yù)期大小相符,經(jīng)測序、blast分析,所插入目的片段正確,大小為189bp,說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖2 PCR檢測重組質(zhì)粒

    2.3 最佳引物濃度篩選結(jié)果

    通過觀察熒光信號的變化可看出各個不同的引物濃度對擴(kuò)增曲線的影響不是很大,但是當(dāng)引物濃度為600nM時,熒光擴(kuò)增曲線最平滑,熒光值最高,呈典型“S”型形狀,平行管測定其重復(fù)性較好,且其Ct值也比其他組要小,說明其擴(kuò)增效率及檢測靈敏度比其它組高,確定引物濃度為600nM時,反應(yīng)較穩(wěn)定,曲線平滑,只有單一的峰,無非特異性擴(kuò)增,為該體系的最佳引物濃度(見圖3)。

    圖3 引物濃度為600nM時的融解曲線圖

    2.4 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

    通過觀察不同退火溫度下擴(kuò)增曲線,看出該反應(yīng)在62℃到52℃之間的溫度變化不敏感,熒光信號均有增加,但是在58℃時PCR擴(kuò)增效率最好,因此確定58℃為該體系的最佳退火溫度(圖4,圖5)。

    圖4 58℃退火溫度下的擴(kuò)增曲線圖

    圖5 58℃退火溫度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    2.5 特異性測試結(jié)果

    圖6顯示:該體系只針對ScYLV樣品進(jìn)行了擴(kuò)增,對測試的SrMV和健康甘蔗樣品都沒有熒光曲線的擴(kuò)增,表明引物特異性好。

    2.6 線性范圍測試結(jié)果

    通過對一系列100倍梯度稀釋的ScYLV標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng),并觀察熒光信號的變化,可以看出當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 6×108拷貝/μL 到 6×101拷貝/μL 時,標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的相關(guān)性,可以檢測的線性范圍為6×l01~6×108拷貝(圖7)。

    圖6 體系特異性檢測結(jié)果

    圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性苑圍

    圖8 實(shí)時定量PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質(zhì)粒1~8:6×108,6×107,6×106,6×105,6×104,6×103,6×102,6×101拷貝/μL 9:負(fù)對照

    圖9 普通PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質(zhì)粒泳道 l~8:6×108,6×107,6×106,6×105,6×104,6×103,6×102,6×101拷貝/μL 9:負(fù)對照

    2.7 靈敏性測試的對比試驗(yàn)

    結(jié)果表明,實(shí)時定量PCR能夠檢測到6×100拷貝/μL重組質(zhì)粒,而常規(guī)PCR只能檢測到6×102拷貝/μL重組質(zhì)粒,實(shí)時定量PCR檢測的靈敏度比常規(guī)PCR提高了100倍(圖8、9)。

    圖11 田間樣品檢測擴(kuò)增曲線

    2.8 重復(fù)性測試結(jié)果

    對濃度高低不同的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定3次和連續(xù)3d對同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,通過計(jì)算獲得該體系的批內(nèi)CV值為1.6%,批間CV值為3.2%,小于5%,說明重復(fù)性較好(圖10)。

    表2 田間ScYLV分離株的實(shí)時熒光RT-qPCR檢測結(jié)果

    2.9 田間樣品測試

    適用性檢測結(jié)果:由表2、圖11可以看出,對來自田間受ScYLV不同致病力(強(qiáng)、弱和中等)感染的株系,該體系均可以進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增和定量檢測,因而可以作為一種適宜的定量和定性檢測手段來研究甘蔗黃葉病毒。

    3 結(jié)論與討論

    本研究建立了利用SYBR Green I染料法檢測ScYLV的實(shí)時熒光RT-PCR體系。該體系相關(guān)性好 (r2=0.993),特異性強(qiáng),線性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好且具有操作簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。檢測結(jié)果真實(shí)可靠,可以定量檢測田間受ScYLV不同致病力(強(qiáng)、弱和中等)感染的株系,其Ct值的高低直接反應(yīng)了各株系中ScYLV含量的高低。同時靈敏度比常規(guī)RT-PCR高出100倍,這不僅減少了假陽性和假陰性問題的出現(xiàn),更適于對那些亞感病或無癥狀感染植株的診斷。大大提高了該病毒的檢出率,克服了常規(guī)PCR因靈敏度不夠而導(dǎo)致樣品檢測出現(xiàn)假陰性的不足。

    因此,本研究建立的實(shí)時熒光RT-PCR體系非常適合于檢測ScYLV這樣在寄主中含量較低的病毒,并且具有成本相對低廉、檢測速度快、無需PCR后處理等諸多優(yōu)點(diǎn)。J.Korimbocus等[11]應(yīng)用Taqman-MGB探針法檢測ScYLV,本文所建立方法與此相比,具有檢測成本低,檢測方便等特點(diǎn),檢測時只需要在反應(yīng)體系中加入模板,檢測的特異性只取決于引物的特異性,適宜大規(guī)??焖贆z測。該方法的建立為ScYLV的檢測、防治以及無病毒苗木的生產(chǎn)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持,也可以應(yīng)用于ScYLV的YLS效果評價(jià)和深入研究中。

    [1]Schenk S.Sugarcane yellow leaf syndrome:history and current concepts[A].In:Rao G P,Ford R E,Tosic M,et al,Sugarcane Pathology[C].Vol.Ⅱ.Enfield,USA,Science Publisher Inc,2001:23-25.

    [2]Rassaby L,Girard J C,Lemaire D,Costet L,Irey M S,Kodja H,Lockhart B E L,Rott P.Spread of sugarcane yellow leaf virus in sugarcane plants and fields on the island of Reunion[J].Plant Pathology,2004,53(1):117-125.

    [3]Izaguirre-Mayoral M L,Carballo D,Alceste C,Romano M,Nass H A.Physiological performance of asymptomatic and yeiiow leaf syndrome-affected sugarcane in Venezuela[J].Journal of Phytopathology,2002,150:13-19.

    [4]Lockkhart B E L,Irey M J,Comstock J C.Sugarcane baccitliform virus,sugarcane mild mosaic virus and sugarcane yellow leaf syndrome[A].In:Sugarcane Germp-lasm Conservation and Exchage B J,Croft C M,PigginE S,Wallis and D M Hogarth(eds),ACIAR Procee-dings[C].1996,67:113-115.

    [5]Schenck S,J S Hu.Uses of tissue blot immunoassay to determine the distribution of sugarcane yellow leaf virus in Hawaii[J].Sugarcane,1997,4:5-8.

    [6]Comstock J C,Irey M S,Lockhart B E L,et a1.Incidence of yellow leaf syndrome in CP cultivars based on polymerase chain reaction and serological techniques[J].Sugarcane,1998,4:21-24.

    [7]王伯輝,朱秋珍,莫磊興,等.甘蔗黃葉綜合癥的RT-PCR檢測初報(bào)[J].甘蔗,2003,10(4):13-14.

    [8]許東林,周國輝,任小平,等.廣東甘蔗引種基地甘蔗黃葉病毒分子鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào),2005,35(5):466-468.

    [9]王洪星,張雨良,羅志文,等.應(yīng)用多重RT-PCR檢測甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,38(10):128-131.

    [10]王洪星,張雨良,羅志文,等.ScYLV和SrMV的PCR引物優(yōu)化設(shè)計(jì)[J].中國糖料,2012(1):16-20.

    [11]J.Korimbocus,D.Coates,I.Barker,and N.Boonham.Improved detection of Sugarcane yellow leaf virus using a real-time fluorescent(TaqMan)RT-PCR assay[J].Journal of Virological Methods,2002,103:109-120.

    猜你喜歡
    拷貝黃葉甘蔗
    “蔗”里時光
    花式賣甘蔗
    茄子黃葉“因”不同 防治方法大不同
    清明甘蔗“毒過蛇”
    黃葉片片步深秋
    嶺南音樂(2019年6期)2019-12-31 02:42:08
    默默黃葉迎初秋
    嶺南音樂(2019年5期)2019-10-29 11:37:40
    “崔黃葉”趣話
    中華詩詞(2019年12期)2019-09-21 08:53:34
    中國生殖健康(2018年1期)2018-11-06 07:14:38
    愛咬甘蔗的百歲爺爺
    特別健康(2018年3期)2018-07-04 00:40:08
    文件拷貝誰最“給力”
    免费av不卡在线播放| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99riav亚洲国产免费| 好男人在线观看高清免费视频| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜福利视频1000在线观看| 国产成人福利小说| 在线免费观看的www视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产伦精品一区二区三区视频9 | or卡值多少钱| 岛国在线免费视频观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 91av网站免费观看| 国产91精品成人一区二区三区| 丁香欧美五月| 天堂√8在线中文| 亚洲激情在线av| 在线视频色国产色| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲av免费在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 18禁观看日本| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 男人舔女人的私密视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩人妻高清精品专区| 男人舔女人的私密视频| 在线视频色国产色| 精品国产美女av久久久久小说| 久久精品国产清高在天天线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产三级黄色录像| 久久久久久九九精品二区国产| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲电影在线观看av| 看黄色毛片网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产人伦9x9x在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 成人三级黄色视频| 日本 av在线| 男女床上黄色一级片免费看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久久久大精品| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品 国内视频| 久9热在线精品视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 麻豆一二三区av精品| www日本在线高清视频| 亚洲中文字幕日韩| 免费在线观看影片大全网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 成人无遮挡网站| 欧美大码av| 怎么达到女性高潮| 91在线观看av| 黄色成人免费大全| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费看a级黄色片| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产视频内射| 黑人欧美特级aaaaaa片| 18美女黄网站色大片免费观看| 久99久视频精品免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久久久久久久中文| 国产精品99久久久久久久久| 国产成人aa在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 99久久精品国产亚洲精品| 少妇的丰满在线观看| 久久人妻av系列| 亚洲av成人一区二区三| 成人三级做爰电影| 此物有八面人人有两片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲av免费在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 嫁个100分男人电影在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 美女 人体艺术 gogo| 精品久久久久久成人av| 国产1区2区3区精品| 国产精品1区2区在线观看.| av中文乱码字幕在线| 国产高清激情床上av| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜亚洲福利在线播放| 久久性视频一级片| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产亚洲精品av在线| 99久久精品一区二区三区| av福利片在线观看| 午夜福利在线在线| 97超视频在线观看视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费人成视频x8x8入口观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩欧美在线二视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美一区二区精品小视频在线| 此物有八面人人有两片| 久久亚洲真实| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲美女黄片视频| 亚洲精华国产精华精| 国产成人aa在线观看| 国产美女午夜福利| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品99久久久久久久久| 曰老女人黄片| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲人成伊人成综合网2020| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 波多野结衣高清作品| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人国产综合亚洲| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久久精品大字幕| 国产一区二区激情短视频| 麻豆国产97在线/欧美| 免费高清视频大片| 两个人视频免费观看高清| 美女 人体艺术 gogo| 成人三级做爰电影| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人永久免费在线观看视频| 1000部很黄的大片| 日本免费a在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产精品合色在线| 成人国产一区最新在线观看| 97超视频在线观看视频| 成人午夜高清在线视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产成人系列免费观看| 日本成人三级电影网站| 此物有八面人人有两片| 草草在线视频免费看| 国模一区二区三区四区视频 | 中文字幕av在线有码专区| 九色国产91popny在线| 国产午夜精品论理片| 国产av麻豆久久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 色噜噜av男人的天堂激情| 一个人免费在线观看电影 | 999久久久国产精品视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产激情久久老熟女| 国产精品1区2区在线观看.| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲专区中文字幕在线| 88av欧美| 91久久精品国产一区二区成人 | e午夜精品久久久久久久| 国产精品久久视频播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲专区字幕在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产视频内射| 国产精品一区二区免费欧美| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲国产欧美网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩中文字幕欧美一区二区| 午夜福利欧美成人| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 后天国语完整版免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜福利在线在线| 成人午夜高清在线视频| 国产v大片淫在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一进一出抽搐gif免费好疼| 变态另类丝袜制服| 香蕉丝袜av| av国产免费在线观看| 亚洲无线在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 午夜福利在线观看吧| 人妻久久中文字幕网| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产一区二区三区视频了| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲性夜色夜夜综合| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 91字幕亚洲| 色吧在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 999久久久精品免费观看国产| 久久久国产欧美日韩av| av在线蜜桃| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品av久久久久免费| 亚洲精品久久国产高清桃花| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本黄色视频三级网站网址| 波多野结衣高清作品| 色综合站精品国产| 国产又色又爽无遮挡免费看| 日本黄大片高清| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美色视频一区免费| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美日本视频| 日本与韩国留学比较| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 黄频高清免费视频| 丝袜人妻中文字幕| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜亚洲福利在线播放| 两个人视频免费观看高清| 免费在线观看成人毛片| 久久热在线av| 小说图片视频综合网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 高清毛片免费观看视频网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 身体一侧抽搐| 床上黄色一级片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美日本视频| 美女大奶头视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 99热这里只有精品一区 | www.999成人在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 波多野结衣巨乳人妻| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美激情在线99| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 全区人妻精品视频| 国产精品九九99| 久久草成人影院| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产一区二区在线观看日韩 | 99热只有精品国产| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲avbb在线观看| 免费av不卡在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩av在线大香蕉| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久久精品大字幕| 国产高潮美女av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产69精品久久久久777片 | 黄色视频,在线免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一级毛片高清免费大全| ponron亚洲| 观看美女的网站| 国产成人av教育| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲专区字幕在线| 丰满的人妻完整版| 国产精华一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91字幕亚洲| 性色av乱码一区二区三区2| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲,欧美精品.| 久久久久国内视频| 两个人看的免费小视频| 国产亚洲精品一区二区www| 国产极品精品免费视频能看的| 88av欧美| 99久久国产精品久久久| 日本熟妇午夜| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 男女之事视频高清在线观看| 天堂影院成人在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 在线免费观看不下载黄p国产 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品精品国产色婷婷| 校园春色视频在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 美女黄网站色视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人aa在线观看| 欧美日韩黄片免| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 观看免费一级毛片| 99热只有精品国产| 天堂网av新在线| 国产精品,欧美在线| 色尼玛亚洲综合影院| 91av网一区二区| 国产亚洲欧美98| 波多野结衣高清无吗| 1024手机看黄色片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 毛片女人毛片| 老汉色∧v一级毛片| 免费观看的影片在线观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 99久久精品一区二区三区| 草草在线视频免费看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 午夜a级毛片| 很黄的视频免费| 久久国产精品影院| 久久久久九九精品影院| 小说图片视频综合网站| 国产精品 国内视频| 老司机在亚洲福利影院| 夜夜爽天天搞| 国语自产精品视频在线第100页| 性色av乱码一区二区三区2| 香蕉久久夜色| а√天堂www在线а√下载| 久久精品国产综合久久久| or卡值多少钱| 亚洲av成人一区二区三| 免费看美女性在线毛片视频| 国产伦在线观看视频一区| 俄罗斯特黄特色一大片| 超碰成人久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩精品网址| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品亚洲一级av第二区| 香蕉国产在线看| 国产一区二区三区视频了| 久久久色成人| 午夜视频精品福利| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲精品在线观看二区| 在线看三级毛片| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成人av教育| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本黄色片子视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美丝袜亚洲另类 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久成人免费电影| 国产成人啪精品午夜网站| 草草在线视频免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线永久观看黄色视频| 日韩欧美在线二视频| 久久99热这里只有精品18| 高清在线国产一区| 亚洲18禁久久av| 免费在线观看日本一区| 亚洲av免费在线观看| 国产成人av激情在线播放| 日日夜夜操网爽| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲国产欧美网| 男人舔女人下体高潮全视频| 成年人黄色毛片网站| 国产精品野战在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲国产色片| 757午夜福利合集在线观看| 国产一区二区激情短视频| www.熟女人妻精品国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av第一区精品v没综合| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品人妻1区二区| 午夜免费激情av| 搞女人的毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久人人精品亚洲av| 男人的好看免费观看在线视频| 日韩欧美在线乱码| 久久精品影院6| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品1区2区在线观看.| 我的老师免费观看完整版| 精品国产亚洲在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产视频内射| 亚洲一区二区三区色噜噜| 18禁美女被吸乳视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 此物有八面人人有两片| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av熟女| 色av中文字幕| av天堂中文字幕网| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 99久久99久久久精品蜜桃| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美日韩精品网址| 精品欧美国产一区二区三| www日本在线高清视频| av视频在线观看入口| 日本成人三级电影网站| 亚洲人成电影免费在线| 成人三级黄色视频| 精品久久久久久久久久久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91在线观看av| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美最黄视频在线播放免费| 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美不卡视频在线免费观看| 香蕉国产在线看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 成人三级做爰电影| 国产成年人精品一区二区| 成人精品一区二区免费| 欧美zozozo另类| 精品不卡国产一区二区三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产成人系列免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成人永久免费在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日韩一级在线毛片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 丝袜人妻中文字幕| 好男人电影高清在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产欧美日韩一区二区三| 成人欧美大片| 日本a在线网址| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜精品在线福利| 18禁观看日本| 精品久久久久久成人av| 天堂√8在线中文| 一本综合久久免费| 99riav亚洲国产免费| 91字幕亚洲| 午夜福利成人在线免费观看| 天堂动漫精品| 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久久久九九精品二区国产| 精品久久蜜臀av无| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲无线在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 麻豆国产av国片精品| av在线蜜桃| aaaaa片日本免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 九色国产91popny在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 岛国在线观看网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 色在线成人网| 91老司机精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲精品在线美女| 久久久国产成人精品二区| 免费av毛片视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久中文字幕一级| 国产精品亚洲一级av第二区| xxxwww97欧美| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产午夜精品论理片| 在线观看午夜福利视频| 亚洲真实伦在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 长腿黑丝高跟| 国产亚洲精品一区二区www| a在线观看视频网站| 全区人妻精品视频| 99久久国产精品久久久| 日韩欧美精品v在线| 亚洲人成网站高清观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产毛片a区久久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| xxx96com| 天堂√8在线中文| 日韩精品中文字幕看吧| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品国产乱码久久久久久男人| 熟女电影av网| 国产欧美日韩一区二区精品| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美大码av| 免费大片18禁| 999久久久精品免费观看国产| 久久久国产成人精品二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产毛片a区久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品美女久久av网站| 一级毛片女人18水好多| 一二三四社区在线视频社区8| 可以在线观看毛片的网站| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品久久久久久久久久久久久| 天堂动漫精品| 久久久精品大字幕| 亚洲国产欧美人成| 搡老熟女国产l中国老女人| 免费搜索国产男女视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 在线观看免费午夜福利视频| 日本五十路高清| 精品久久蜜臀av无| 人人妻人人澡欧美一区二区| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久久人人人人人| 国产高清视频在线观看网站| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜影院日韩av| 日本黄色片子视频| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜福利18| 欧美一级毛片孕妇| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲av免费在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 18禁国产床啪视频网站| 毛片女人毛片| 国产爱豆传媒在线观看| 国产日本99.免费观看| 国产不卡一卡二| 国产综合懂色| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产熟女xx| 我要搜黄色片| 九九在线视频观看精品| a在线观看视频网站| 久久精品人妻少妇| 国产单亲对白刺激| 亚洲激情在线av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美成人性av电影在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 波多野结衣高清无吗| aaaaa片日本免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲,欧美精品.| 中文字幕av在线有码专区| 午夜亚洲福利在线播放|