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    甘蔗黃葉病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測體系研究

    2013-07-26 13:53:02王洪星張雨良王健華劉志昕
    中國糖料 2013年1期
    關(guān)鍵詞:拷貝黃葉甘蔗

    王洪星,龔 殿,張雨良,王健華,劉志昕

    (中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,海南 ???71101)

    甘蔗黃葉?。ㄔ缙诜Q甘蔗黃葉綜合癥)于20世紀(jì)80年代末首先報(bào)道在美國夏威夷發(fā)生,90年代初在巴西造成嚴(yán)重危害,目前幾乎已擴(kuò)散至世界各產(chǎn)蔗國。該病的癥狀常出現(xiàn)在植株生長的中后期,在干旱條件下癥狀表現(xiàn)早而明顯,造成感病品種嚴(yán)重減產(chǎn)[1-3]。其病原ScYLV屬于黃癥病毒科(Luteroviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus),病毒粒體球形,直徑22~24 nm,在寄主體內(nèi)含量很低,僅分布于韌皮部篩管伴胞細(xì)胞質(zhì)中。Lockhart[4]首先利用電子顯微鏡在感病植株葉片韌皮部伴胞細(xì)胞質(zhì)中觀察到多面體ScYLV粒體;隨后利用抗血清技術(shù)檢測該病毒;Schenck[5]利用組織印跡雜交免疫法(TBIA)檢測ScYLV;Comstock[6]采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定方法(DAS-ELISA)進(jìn)行病原檢測。王伯輝等[7]在廣西觀察到甘蔗黃葉病并對其病原進(jìn)行了初步的檢測,許東林等[8]報(bào)道了發(fā)生在廣東蔗區(qū)的ScYLV分子鑒定結(jié)果。與目前使用的生物學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR等ScYLV檢測技術(shù)相比,實(shí)時熒光PCR技術(shù)不但靈敏度高于傳統(tǒng)PCR,而且能對病原體的數(shù)量進(jìn)行精確定量。SYBR Green I染料法具有靈敏度高、信噪比高、適用范圍廣和低價(jià)等特點(diǎn)。在核酸的實(shí)時檢測方面有很多優(yōu)點(diǎn),由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合,不必因?yàn)槟0宀煌貏e定制,因此設(shè)計(jì)的程序通用性好,且價(jià)格相對較低,可提高ScYLV的檢測效果。我們進(jìn)行了ScYLV的實(shí)時熒光RT-PCR檢測技術(shù)研究,以期建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏和簡便的檢測ScYLV的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料為經(jīng)檢測感染了甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒的植株,甘蔗感病材料采自海南省紅毛鎮(zhèn)甘蔗種植基地。

    主要試劑和儀器:Mx3005型熒光定量 PCR儀、TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒、RT-PCR試劑盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0購自寶生物工程(大連)有限公司,Taq酶及其它生物試劑均購自北京全式金生物科技有限公司,其它藥品為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 總核酸的提取 從待檢測甘蔗植株上取幼嫩組織,以TRIzol法[9]提取RNA樣品。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 選取在GenBank上 (登錄號AF369923.1、AF369924.1、AF369925.1、AF369926.1、AF369927.1、AF369928.1、AF369929.1、AF141385.1、AF141385.1)登錄的 9 個 ScYLV 分離物高度保守的衣殼蛋白基因序列中,運(yùn)用Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進(jìn)行基因同源性分析和引物設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成[10]。

    1.2.3 RT-PCR 以所提取病樣的總RNA為模板,以oligodT為反轉(zhuǎn)錄引物,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μL,反應(yīng)成分包括ScYLV CDNA2μL、10 pm/μL 上游引物 s-pf 1μL、10pm/μL 下游引物 s-pr1μL,10mM dNTP2 μL、Taq 酶 0.2μL、無菌水18.8μL。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min,95℃變性30 s,53℃退火1 min,72℃延伸1 min,循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min。取10μL PCR產(chǎn)物與lμL染料相混合,在室溫下進(jìn)行1.2%瓊脂糖恒壓凝膠電泳。PCR產(chǎn)物利用純化試劑盒進(jìn)行切膠純化。

    表1 用于實(shí)時定量PCR擴(kuò)增的引物特征

    1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選、鑒定與稀釋 按照PMD19-T-Vector試劑盒的操作說明將PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體進(jìn)行連接,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-CD201感受態(tài)細(xì)胞。從已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞中提取重組質(zhì)粒,操作按照Axygen公司的質(zhì)粒小量抽提試劑盒進(jìn)行,用菌液PCR法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定;將鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。同時用紫外分光光度計(jì)測定其濃度為1.16 μg/μL,按照公式CN=M×N/L×D計(jì)算其拷貝數(shù)。CN為質(zhì)??截悢?shù),M為檢測到的核酸最小濃度,N為Avgadro's number(6.022×l023molecules/mol);L為核酸長度(質(zhì)??傞L+插入目的片段長度,單位為kb),D為從1kb核酸轉(zhuǎn)化到道爾頓轉(zhuǎn)化因子(dsDNA=6.6×l05)。經(jīng)計(jì)算,得質(zhì)粒的拷貝數(shù)為6.0×109拷貝/μL。加入滅菌水以10倍為梯度將重組質(zhì)粒依次稀釋,放入-20℃冰箱備用。

    1.2.5 引物濃度的優(yōu)化和退火溫度的優(yōu)化 以200nM、400nM、600nM、800nM四個引物濃度梯度進(jìn)行篩選;然后以優(yōu)化的引物濃度,以6×109拷貝/μL到6×102拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板,選取56℃到62℃的10個不同退火溫度進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng),每個梯度設(shè)置兩個重復(fù),觀察不同梯度引物濃度、不同退火溫度對熒光信號的影響。同時在最優(yōu)的反應(yīng)體系和條件下反應(yīng),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.6 特異性測試與重復(fù)性測試 選取感染高粱花葉病毒植株樣品和健康植株樣品的總核酸與ScYLV總核酸,在相同體系和條件下進(jìn)行擴(kuò)增,觀察熒光信號的變化;同時通過批內(nèi)和批間重復(fù)性測試,驗(yàn)證檢測體系的穩(wěn)定性。批內(nèi)重復(fù)性測試是通過對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定3次,批間重復(fù)性測試是連續(xù)3d對同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,通過測得的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)而計(jì)算CV值。

    1.2.7 線性范圍測試 以100倍梯度稀釋的6×108拷貝/μL到6×101拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板,在上述優(yōu)化的體系進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng),通過觀察熒光信號的變化和r2值的大小,確定該體系的線性范圍。

    1.2.8 靈敏性測試的對比試驗(yàn) 分別對己知濃度的ScYLV標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋,以此為模板分別進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)和普通PCR反應(yīng),驗(yàn)證所建立的檢測方法的靈敏性。

    1.2.9 田間樣品檢測 利用已建立的方法對來自田間的13份疑似樣品進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的片段擴(kuò)增

    利用RT-PCR法擴(kuò)增獲得的ScYLV CP基因的插入用目的片段,特異性PCR產(chǎn)物片段長度與預(yù)計(jì)目的片段大小基本一致(圖1)。

    圖1 RT-PCR法擴(kuò)增ScYLVCP基因的插入用目的片段

    2.2 ScYLV目的基因重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

    鑒定結(jié)果如圖2:獲得目的片段與預(yù)期大小相符,經(jīng)測序、blast分析,所插入目的片段正確,大小為189bp,說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖2 PCR檢測重組質(zhì)粒

    2.3 最佳引物濃度篩選結(jié)果

    通過觀察熒光信號的變化可看出各個不同的引物濃度對擴(kuò)增曲線的影響不是很大,但是當(dāng)引物濃度為600nM時,熒光擴(kuò)增曲線最平滑,熒光值最高,呈典型“S”型形狀,平行管測定其重復(fù)性較好,且其Ct值也比其他組要小,說明其擴(kuò)增效率及檢測靈敏度比其它組高,確定引物濃度為600nM時,反應(yīng)較穩(wěn)定,曲線平滑,只有單一的峰,無非特異性擴(kuò)增,為該體系的最佳引物濃度(見圖3)。

    圖3 引物濃度為600nM時的融解曲線圖

    2.4 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

    通過觀察不同退火溫度下擴(kuò)增曲線,看出該反應(yīng)在62℃到52℃之間的溫度變化不敏感,熒光信號均有增加,但是在58℃時PCR擴(kuò)增效率最好,因此確定58℃為該體系的最佳退火溫度(圖4,圖5)。

    圖4 58℃退火溫度下的擴(kuò)增曲線圖

    圖5 58℃退火溫度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    2.5 特異性測試結(jié)果

    圖6顯示:該體系只針對ScYLV樣品進(jìn)行了擴(kuò)增,對測試的SrMV和健康甘蔗樣品都沒有熒光曲線的擴(kuò)增,表明引物特異性好。

    2.6 線性范圍測試結(jié)果

    通過對一系列100倍梯度稀釋的ScYLV標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng),并觀察熒光信號的變化,可以看出當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 6×108拷貝/μL 到 6×101拷貝/μL 時,標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的相關(guān)性,可以檢測的線性范圍為6×l01~6×108拷貝(圖7)。

    圖6 體系特異性檢測結(jié)果

    圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性苑圍

    圖8 實(shí)時定量PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質(zhì)粒1~8:6×108,6×107,6×106,6×105,6×104,6×103,6×102,6×101拷貝/μL 9:負(fù)對照

    圖9 普通PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質(zhì)粒泳道 l~8:6×108,6×107,6×106,6×105,6×104,6×103,6×102,6×101拷貝/μL 9:負(fù)對照

    2.7 靈敏性測試的對比試驗(yàn)

    結(jié)果表明,實(shí)時定量PCR能夠檢測到6×100拷貝/μL重組質(zhì)粒,而常規(guī)PCR只能檢測到6×102拷貝/μL重組質(zhì)粒,實(shí)時定量PCR檢測的靈敏度比常規(guī)PCR提高了100倍(圖8、9)。

    圖11 田間樣品檢測擴(kuò)增曲線

    2.8 重復(fù)性測試結(jié)果

    對濃度高低不同的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定3次和連續(xù)3d對同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,通過計(jì)算獲得該體系的批內(nèi)CV值為1.6%,批間CV值為3.2%,小于5%,說明重復(fù)性較好(圖10)。

    表2 田間ScYLV分離株的實(shí)時熒光RT-qPCR檢測結(jié)果

    2.9 田間樣品測試

    適用性檢測結(jié)果:由表2、圖11可以看出,對來自田間受ScYLV不同致病力(強(qiáng)、弱和中等)感染的株系,該體系均可以進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增和定量檢測,因而可以作為一種適宜的定量和定性檢測手段來研究甘蔗黃葉病毒。

    3 結(jié)論與討論

    本研究建立了利用SYBR Green I染料法檢測ScYLV的實(shí)時熒光RT-PCR體系。該體系相關(guān)性好 (r2=0.993),特異性強(qiáng),線性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好且具有操作簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。檢測結(jié)果真實(shí)可靠,可以定量檢測田間受ScYLV不同致病力(強(qiáng)、弱和中等)感染的株系,其Ct值的高低直接反應(yīng)了各株系中ScYLV含量的高低。同時靈敏度比常規(guī)RT-PCR高出100倍,這不僅減少了假陽性和假陰性問題的出現(xiàn),更適于對那些亞感病或無癥狀感染植株的診斷。大大提高了該病毒的檢出率,克服了常規(guī)PCR因靈敏度不夠而導(dǎo)致樣品檢測出現(xiàn)假陰性的不足。

    因此,本研究建立的實(shí)時熒光RT-PCR體系非常適合于檢測ScYLV這樣在寄主中含量較低的病毒,并且具有成本相對低廉、檢測速度快、無需PCR后處理等諸多優(yōu)點(diǎn)。J.Korimbocus等[11]應(yīng)用Taqman-MGB探針法檢測ScYLV,本文所建立方法與此相比,具有檢測成本低,檢測方便等特點(diǎn),檢測時只需要在反應(yīng)體系中加入模板,檢測的特異性只取決于引物的特異性,適宜大規(guī)??焖贆z測。該方法的建立為ScYLV的檢測、防治以及無病毒苗木的生產(chǎn)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持,也可以應(yīng)用于ScYLV的YLS效果評價(jià)和深入研究中。

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