枯草芽孢桿菌啟動子的克隆及功能驗證

許丹青，李仁寬，2，林 娟，2，嚴 芬，2，葉秀云，2

(1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350116;2.酶高效表達國家工程實驗室，福建福州 350002)

0 引言

枯草芽孢桿菌是繼大腸桿菌后另一重要的模式細菌［1］.細菌系統(tǒng)因成本低、發(fā)酵周期短和遺傳背景清楚等原因成為人們感興趣的宿主，細菌系統(tǒng)最常用的宿主有大腸桿菌和芽孢桿菌［2］.枯草芽孢桿菌是最先應用于表達系統(tǒng)的芽孢桿菌，已被開發(fā)成生產(chǎn)蛋白和其他化學產(chǎn)品的生產(chǎn)宿主［3］.與大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)具有較多的優(yōu)越性:①無致病性，且被認為是GRAS級的有機體［4］;②沒有明顯的密碼子偏好性［5］;③可將功能性胞外蛋白分泌到培養(yǎng)基中，簡化了分離純化工藝［6］.而大腸桿菌由于其細胞壁結構的原因，在細胞膜外有一層外膜，所以只能將蛋白分泌到周質(zhì)［7］.

自完成基因組測序以來，枯草芽孢桿菌的許多編碼基因被鑒定，調(diào)節(jié)機制和調(diào)控元件逐漸被認識.在所有的調(diào)控元件中，啟動子在枯草芽孢桿菌基因工程菌中扮演著重要角色［8］.選擇合適的啟動子作為調(diào)控元件，是重組蛋白高效表達的關鍵因素之一［9］.到目前為止，已經(jīng)獲得一系列的枯草芽孢桿菌啟動子，而且有些已經(jīng)被成功應用于枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng).

本實驗室曾從枯草芽孢桿菌中克隆到了可被蔗糖誘導的果聚糖蔗糖酶啟動子和信號肽序列PSacB和α－淀粉酶啟動子PamyE，在他們的調(diào)控下分別實現(xiàn)了枯草芽孢桿菌α－淀粉酶的分泌表達并具有活性.為了分離得到更多的強啟動子片段，為枯草芽孢桿菌作為外源蛋白表達宿主的研究奠定基礎，本研究構建了以卡那霉素抗性基因為報告基因的啟動子探針載體pHT－kan，以鳥槍法處理枯草芽孢桿菌基因組，并在大腸桿菌中分離啟動子活性片段，最后在枯草芽孢桿菌中驗證啟動子的功能.

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(E.coli)TOP10、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)168和大腸桿菌－枯草桿菌穿梭質(zhì)粒pHT01［10］均由本實驗室保藏.

1.2 酶和試劑

PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和基因組提取試劑盒購自上海生物工程公司;rTaq DNA Polymerase購自TIANGEN公司;限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、Sau3AⅠ、T4 DNA連接酶和低分子量標準蛋白質(zhì)均購自TaKaRa公司;氨芐青霉素、卡那霉素，山梨醇、甘露醇、瓊脂糖、酵母提取物、蛋白胨和氯化鈉等購自上海生物工程公司.

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，根據(jù)實驗需要添加適當濃度的抗生素，氨芐青霉素(AMP)的終濃度為 100 μg·mL－1(E.coli);卡那霉素(KM)的終濃度為 40 μg·mL－1(E.coli)和 10 μg·mL－1(B.subtilis).

1.4 枯草芽孢桿菌基因組DNA的提取

?。?0℃保藏的枯草芽孢桿菌168菌株，接種于5 mL LB培養(yǎng)基，37℃，200 r·min－1過夜培養(yǎng).取1 mL過夜培養(yǎng)物12 000 r·min－1離心1 min，然后采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細菌)提取基因組DNA.

1.5 卡那霉素抗性基因的克隆及啟動子探針的構建

根據(jù)pET28a(+)中卡那霉素抗性基因的序列，利用VectorNTI軟件設計合成一對引物P1、P2，用于克隆不含啟動子的卡那霉素抗性基因.

其中:P1為卡那霉素抗性基因上游引物，在起始密碼子ATG的上游在SacⅠ后引入BamHⅠ(GGATCC)酶切位點，用于啟動子片段的插入.以含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pET28a(+)為模板，擴增卡那霉素抗性基因片段.純化回收的PCR產(chǎn)物與PCR2.1克隆載體4℃連接過夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR驗證后，提取質(zhì)粒酶切驗證，構建成功的載體命名為PCR2.1－kan.

PCR2.1－kan用SacⅠ、XbaⅠ雙酶切凝膠純化回收小片段約816 bp，pHT01經(jīng)同樣雙酶切純化回收大片段，兩種純化回收產(chǎn)物連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR驗證和酶切驗證，送測.構建成功的啟動子探針命名為pHT－kan.

1.6 啟動子活性片段的克隆

采用同尾酶的策略，BamHⅠ(識別序列為GGATCC)與Sau3AⅠ(識別序列為GATC)的粘性末端相同，且Sau3AⅠ識別4個堿基，因此，理論上枯草芽孢桿菌基因組可被Sau3AⅠ切成256 bp左右的片段，這與枯草芽孢桿菌啟動子片段大小100～500 bp左右相接近.用Sau3AⅠ酶切枯草芽孢桿菌168基因組，純化回收后與經(jīng)BamHⅠ酶切并去磷酸化的pHT－kan連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，涂布于40 μg·mL－1卡那霉素抗性LB平板.

從卡那霉素抗性平板中挑取長的大而圓的轉(zhuǎn)化子，點種在100 μg·mL－1卡那霉素平板上.用含不同卡那霉素濃度梯度的LB液體培養(yǎng)基檢測所有啟動子的抗性水平.最后篩選出抗性最高的幾個啟動子，對其進行菌落PCR驗證并測序.

1.7 啟動子測序及序列的分析

在SacⅠ上游設計合成測序引物P3:5’－GCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCC－3’，對抗性最高的幾個啟動子進行測序和序列分析.通過以下在線分析網(wǎng)站分析啟動子片段:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NCBI;

http://www.fruitfly.org/ 啟動子在線分析網(wǎng)站;

http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ 枯草芽孢桿菌168全基因組數(shù)據(jù)庫.

對測序的結果進行分析，根據(jù)預測的啟動子功能區(qū)域，結合枯草芽孢桿菌σ因子的特點，推測其－35區(qū)、－10區(qū)，根據(jù)枯草芽孢桿菌數(shù)據(jù)庫確定核糖體結合位點RBS，選取其中的幾個啟動子進行啟動子功能驗證.

1.8 啟動子功能驗證

選取幾個經(jīng)測序和序列分析的重組子提取質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)法［11］轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌168感受態(tài)細胞，重組菌經(jīng)含卡那霉素抗性LB平板篩選后采用卡那霉素抗性梯度驗證啟動子的強度.

2 結果

2.1 枯草芽孢桿菌基因組DNA的提取

采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細菌)提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證提取成功后方可進行后續(xù)試驗.

2.2 卡那霉素抗性基因的克隆及啟動子探針的構建

采用設計的引物P1、P2，以pET28a(+)為模板，通過PCR擴增出卡那霉素抗性基因.TA克隆連接到PCR2.1上，構建PCR2.1－kan.PCR2.1－kan經(jīng)SacⅠ、XbaⅠ雙酶切后，被切成兩條帶，結果見圖1.說明目的基因已經(jīng)克隆到PCR2.1上.

pHT01－kan經(jīng)SacⅠ、XbaⅠ雙酶切后，被切成兩條帶，證明目的基因已經(jīng)插入pHT01(圖2)，啟動子探針載體構建成功.

圖1 PCR2.1－kan雙酶切驗證Fig.1 Identification of PCR2.1 － kan by enzyme digestion

圖2 pHT－kan雙酶切驗證Fig.2 Identification of pHT － kan by enzyme digestion

2.3 啟動子活性片段的克隆

取適量的枯草芽孢桿菌基因組DNA在37℃進行酶切，控制酶切反應體系中的Sau3AⅠ酶活單位，使得基因組DNA經(jīng)酶切1 h后的片段集中在100～1 000 bp之間，pHT－kan經(jīng)BamHⅠ酶切并去磷酸化，純化回收上述酶切產(chǎn)物，結果見圖3.

取上述回收產(chǎn)物各適量酶連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP感受態(tài)細胞，涂布于40 μg·mL－1卡那霉素抗性LB平板.經(jīng)驗證幾乎所有具有抗性的轉(zhuǎn)化子均可在100 μg·mL－1的卡那霉素平板上生長.挑取100個大而圓轉(zhuǎn)化子，點種在100 μg·mL－1卡那霉素抗性LB平板上保存，依次命名為pHT－BSPx－kan，x=1，2，…，10.將這些轉(zhuǎn)化子接種在500、1 000、2 000和3 000 μg·mL－1卡那霉素液體LB中進行抗性梯度篩選.實驗表明隨著卡那霉素濃度的升高，轉(zhuǎn)化子的生長個數(shù)逐漸減少，因此根據(jù)轉(zhuǎn)化子的生長水平，可反應啟動子活性片段在大腸桿菌中對卡那霉素抗性基因的啟動強度.最終獲得高抗性轉(zhuǎn)化子pHT－BSP25－kan和 pHT －BSP31 －kan，他們的抗性水平可達2 000 μg·mL－1.

對其中抗性較高的啟動子進行菌落PCR驗證，驗證所采用的引物在卡那霉素抗性基因插入位點的上游和下游.若啟動子探針未插入啟動子活性片段，則PCR產(chǎn)物大小在1 000 bp左右，由圖4可以看出:PCR產(chǎn)物菌落在1 000～1 500 bp之間，因此啟動子活性片段小于500 bp，這與枯草芽孢桿菌啟動子片段大小相符.

圖3 啟動子片段的克隆Fig.3 Cloning of promoter fragment

圖4 啟動子活性克隆菌落PCR驗證Fig.4 PCR analysis of recombinant clones

2.4 啟動子測序及序列分析

對啟動子活性片段BSP25和BSP31進行測序，序列測定由上海生工完成.序列如圖5.

圖5 啟動子序列分析Fig.5 Analysis of promoters

BSP25長242 bp，經(jīng)Blast序列比對，與枯草芽孢桿菌168基因組同源性達100%，查詢枯草芽孢桿菌168基因組數(shù)據(jù)庫，前133 bp在yhjO的3’端，從131個堿基開始的3個堿基TAG為yhjO的終止子.yhjN基因的啟動子部分與yhjO的3’端重疊，這與原核細菌基因的重疊現(xiàn)象一致，最后3個堿基為yhjN基因的起始密碼子TTG，起始密碼子后有10個氨基酸與卡那霉素抗性基因發(fā)生了融合，但后者的閱讀框并沒有改變，因此不影響卡那霉素抗性基因的活性.

BSP31長128 bp，經(jīng)Blast序列比對，與枯草芽孢桿菌168基因組同源性達99%，查詢枯草芽孢桿菌168基因組數(shù)據(jù)庫，它是yktD基因的啟動子，其第一個堿基再往上游228 bp處為nprE的終止子TTG，最后3個堿基為起始密碼子ATG.yhjN和yktD基因的功能未知.

采用啟動子在線分析網(wǎng)站對BSP25和BSP31進行啟動子功能區(qū)域預測(表1)，結果表明兩者均含有啟動子功能片段，啟動子可能性的預測值均大于94%.

表1 啟動子BSP25、BSP31結構預測Tab.1 Promoter prediction for BSP25 and BSP31

根據(jù)預測的結果，結合枯草芽孢桿菌σ因子的特點，預測啟動子區(qū)域的－35區(qū)、－10區(qū)，結果標在序列處.其中BSP25與營養(yǎng)生長時期σC識別的啟動子相似，BSP31與早期生長時期σA識別的啟動子相似.核糖體結合位點RBS的序列則由枯草芽孢桿菌基因組數(shù)據(jù)庫直接確定.

2.5 啟動子功能驗證

提取質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)法將含有BSP25和BSP31片段的質(zhì)粒pHT－BSP25－kan和pHT－BSP31－kan轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌168感受態(tài)細胞，涂布卡那霉素抗性平板，過夜培養(yǎng)后長出具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子.實驗結果表明，啟動子BSP25和BSP31能夠啟動卡那霉素在枯草芽孢桿菌中表達.挑取其中的幾個克隆接種在含500、1 000、2 000和3 000 μg·mL－1卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，檢查其抗性水平，實驗結果列于表2.

表2 重組枯草芽孢桿菌的卡那霉素抗性水平Tab.2 Kanamycin resistance level of the recombinant B.subtilis

實驗表明，168/pHT－BSP25－kan和168/pHT－BSP31－kan均可在2 000 μg·mL－1卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中生長，其抗性水平和在大腸桿菌中相當.該實驗結果表明在大腸桿菌中克隆篩選得到的啟動子片段，可在枯草芽孢桿菌中啟動卡那霉素抗性基因的表達.因此采用在大腸桿菌中篩選枯草芽孢桿菌啟動子的方法是可行的.

3 討論

盡管枯草芽孢桿菌168已于1997年完成全基因組測序，且一些公認的啟動子如PSacB［12］、P43［13］、PamyE［14］等已被較多地研究和應用.但到目前為止，枯草芽孢桿菌基因組的很多基因功能尚屬未知.因此，有必要繼續(xù)克隆分析得到更多的強啟動子活性片段，為枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的應用奠定基礎.

啟動子克隆的常用方法有啟動子探針載體、環(huán)狀PCR和TAlL－PCR等，其中枯草芽孢桿菌最常用的啟動子克隆方法是啟動子探針載體.構建啟動子探針載體時常用的報告基因有:綠色熒光蛋白基因和抗生素抗性基因，還有一些實驗室利用特定的酶作為報告基因.以綠色熒光蛋白作為報到基因還需要通過熒光光度計來測定才能分析啟動子強度，儀器設備較為繁瑣.pHT01本身具有氨芐青霉素和氯霉素抗性，因此本實驗采用卡那霉素抗性基因作為報告基因，且用卡那霉素濃度梯度篩選，操作簡單，并能較好地指示啟動子的強度.

pHT01載體是MoBiTec公司的大腸桿菌－枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒，因此在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中均有自主復制的功能，如果啟動子適合也可在兩種宿主菌中實現(xiàn)目的基因的表達.用不含啟動子的卡那霉素抗性基因替換其啟動子和LacI部分，故可用于篩選具有啟動子活性的枯草芽孢桿菌堿基片段.實驗研究表明，在大腸桿菌中篩選的啟動子活性片段也能在枯草芽孢桿菌中調(diào)控目的基因的表達，因此，該啟動子克隆方法可為枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的研究提供實驗支持.

構建啟動子篩選載體，建立一種枯草芽孢桿菌啟動子篩選和啟動子活性驗證的方法.對于篩選到的較高效啟動子，今后可開展對啟動子片段進行刪減實驗，或者把BSP25起始密碼子后10個氨基酸去掉，進一步研究啟動子活性的變化情況.

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