維生素E對(duì)青魚幼魚生長(zhǎng)、免疫及抗氨氮脅迫能力的影響

黃 云 胡 毅 文 華 鐘 蕾 郇志利李金龍 毛小偉,4 肖調(diào)義

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 淡水生態(tài)與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430223; 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 無錫 214081;4.益陽益華水產(chǎn)品有限公司, 益陽 413000)

在高密度集約化養(yǎng)殖中, 水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物殘餌和排泄物氨化作用產(chǎn)生大量氨態(tài)氮, 是誘發(fā)魚病的主要環(huán)境因子。大多數(shù)硬骨魚類對(duì)氨氮毒性非常敏感[1,2]。水體中過高的氨氮濃度能干擾生物體抗氧化系統(tǒng),使部分抗氧化物質(zhì)含量和酶活性下降[3,4], 機(jī)體清除自由基的能力降低, 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多, 導(dǎo)致機(jī)體非特異性免疫防御系統(tǒng)遭到破壞[5], 外源病菌的易感性增加[6—8]; 鰓、腎、肝等組織結(jié)構(gòu)病變, 呼吸和排泄系統(tǒng)受損[9—11]。近年來, 通過營養(yǎng)學(xué)調(diào)控理論, 提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫機(jī)能, 緩解外界環(huán)境應(yīng)激越來越受到關(guān)注。維生素E(VE)是Evans在19世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)的具有α-生育酚生物活性的一類脂溶性維生素, 其第六位碳原子上羥基極易被氧化, 具有很強(qiáng)的還原性, 是生物體內(nèi)最重要的脂溶性抗氧化劑和免疫增強(qiáng)劑[12]。相關(guān)研究表明, 維生素E參與水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)胞免疫和體液免疫[13,14], 可提高細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、抗體滴度和吞噬細(xì)胞指數(shù), 促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的有絲分裂[15]; 還可有效增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物抵抗亞硝酸鹽[16]、酸應(yīng)激[17]和擁擠脅迫能力[18]。青魚(Mylopharyngodon piceus)是我國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖魚類的四大家魚之一, 在人工養(yǎng)殖過程中面臨水體環(huán)境突變(以氨氮突變?yōu)橹?和疾病滋生等問題。本研究通過飼料中VE的添加, 探討VE對(duì)青魚生長(zhǎng)、免疫和抗氨氮脅迫能力的影響, 以期為 VE的營養(yǎng)調(diào)控青魚抵抗外界環(huán)境應(yīng)激提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與馴化

實(shí)驗(yàn)青魚為購自湖南水產(chǎn)科學(xué)研究所的同一批魚苗。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于室外水泥池(5.0 m×1.0 m×1.5 m)中馴化2周, 日飽食投喂商品飼料2次(8：00, 16：00),日換水量占總體積1/3。暫養(yǎng)期間, 水溫 (24±3), ℃pH 7.31±0.2, 溶解氧含量5.0 mg/L以上, 并用次溴酸鹽氧化法進(jìn)行水體氨氮監(jiān)測(cè), 總氨氮值小于或等于0.2 mg/L, 正式試驗(yàn)前停食24h。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照商品飼料配方, 配制粗蛋白 36.0%和粗脂肪6.0%的基礎(chǔ)飼料(總能約18.0 kJ/g, 表1), 以VE醋酸酯(干粉狀, 含量 50%, 青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司友情提供)作為 VE添加源, 在基礎(chǔ)飼料中分別添加 VE 0(對(duì)照組)、12.5、25、50、100 和 200 mg/kg,共配制6組實(shí)驗(yàn)飼料。飼料原料經(jīng)粉碎后過40目篩,微量成分采取逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻, 采用雙螺旋壓條機(jī)擠壓出1.5 mm粒徑飼料顆粒, 于陰涼處風(fēng)干后?20℃保存?zhèn)溆?。各處理組飼料實(shí)測(cè)值分別為：14.36、25.14、37.66、62.97、113.92和 210.45 mg/kg。

挑選健康活潑、規(guī)格一致的實(shí)驗(yàn)青魚于室內(nèi)水族箱中投喂基礎(chǔ)飼料馴化, 1周后挑選規(guī)格均勻的青魚[初始質(zhì)量(7.27±0.40) g]隨機(jī)分配到 18個(gè)水族箱中, 每箱放養(yǎng) 30尾, 每組3個(gè)重復(fù), 日投餌量為體質(zhì)量的 3%—5%, 分 2次投喂(8：00—9：00, 16：00—17：00), 分別占總量的40%和60%。日換水1次, 換水量占總體積1/3并清除箱內(nèi)糞便。日充氣12h, 溶氧不低于5.0 mg/L。實(shí)驗(yàn)期間平均水溫 (28±2), ℃pH 7.31±0.2, 養(yǎng)殖水總氨氮濃度低于 0.2 mg/L, 自然光周期, 養(yǎng)殖持續(xù)8周。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 青魚饑餓 24h, 從每個(gè)水族箱中撈取青魚置于盛有少量水的桶中, 計(jì)數(shù)、稱重, 記錄生長(zhǎng)情況。根據(jù)生長(zhǎng)情況,選擇有代表性的3組, 未添加VE組、生長(zhǎng)最好組和高水平VE添加組, 即對(duì)照組、62.97和210.45 mg/kg VE組, 每箱隨機(jī)撈取10尾試驗(yàn)青魚, 進(jìn)行24h氨氮脅迫試驗(yàn), 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)參照胡毅等[19]方法, 為了減少捕撈應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響, 在進(jìn)行麻醉前將撈取的青魚放于盛有 20 L水的水箱中靜置 60min,然后滴入丁香油溶液短暫麻醉, 進(jìn)行樣品的采集工作。需進(jìn)行氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)的處理組青魚, 在計(jì)數(shù)、稱重、記錄生長(zhǎng)情況后, 隨機(jī)撈取10尾青魚放于盛有10 L水的水箱中靜置60min后, 緩慢倒入配置好的40 mg/L氨氮溶液10 L, 使水體氨氮濃度達(dá)到20 mg/L左右, 每個(gè)水族箱的氨氮脅迫起始時(shí)間控制間隔在15min左右, 以便于24h后樣品采集時(shí)脅迫時(shí)間一致。脅迫后為避免撈取應(yīng)激, 直接滴入丁香油至水族箱中進(jìn)行短暫麻醉取樣。期間連續(xù)充氣, 保證溶氧不低于5.0 mg/L。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Formulation and chemical composition of the basal diet

1.3 樣品采集、分析與計(jì)算

生長(zhǎng)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)起始和結(jié)束時(shí), 分別對(duì)各水族箱中青魚進(jìn)行記數(shù)、稱重。

特定生長(zhǎng)率(SGR)= [(LnWf? LnWi)/T]×100%

Wf、Wi和T分別表示平均終體重(g)、平均初體重(g)和飼養(yǎng)時(shí)間(d)。

飼料和組織維生素E含量 在氨氮脅迫前后,分別從每個(gè)水族箱隨機(jī)取 3尾試驗(yàn)青魚, 冰盤上解剖并分離出肝臟和軸上肌, 稱取一定量肝臟或肌肉,搗碎、勻漿、離心, 制備上清液備用。肝臟、肌肉和血清中VE含量均參照南京建成VE含量測(cè)定試劑盒比色法測(cè)定。飼料中 VE含量利用高效液相層析色譜(HPLC)測(cè)定。

血清指標(biāo) 在氨氮脅迫前后, 從各試驗(yàn)水族箱中隨機(jī)撈取8尾試驗(yàn)青魚, 放入盛有0.15 mL/L丁香油溶液中短暫麻醉, 用 1 mL無菌注射器尾靜脈采血, 置于無菌離心管中, 4℃靜置12h, 3500 r/min離心15min, 取上層血清移入離心管中放置?80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

皮質(zhì)醇(COR)采用上海繼錦化學(xué)科技有限公司魚ELISA試劑盒測(cè)定, 丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性采用南京建成生物科技研究所試劑盒測(cè)定。

鰓絲Na+/K+-ATP酶活力 在氨氮脅迫前后,冰浴條件下, 取試驗(yàn)青魚兩側(cè)第 2鰓弓上的鰓絲,用生理鹽水潤洗, 濾紙吸干水分, 用于鰓絲 Na+/K+-ATP酶(NKA)活性測(cè)定。其測(cè)定參照胡毅等[19]的方法。NKA活性單位定義為： 以每小時(shí)每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1個(gè) ATP 酶活力單位 [μmol P/(mg·h)]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 用 SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析, 當(dāng)差異顯著時(shí)(P<0.05),則采用Duncan進(jìn)行多重比較; 用t檢驗(yàn)檢測(cè)氨氮脅迫前后的變化。

2 結(jié)果

2.1 維生素E對(duì)青魚幼魚生長(zhǎng)的影響

隨著飼料中VE含量的增加, 青魚幼魚SGR呈升高趨勢(shì), 當(dāng) VE含量達(dá)到或超過 37.66 mg/kg時(shí),其SGR均顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 且37.66、62.97、113.92和 210.45 mg/kg VE組組間無顯著差異(圖1A)。經(jīng)折線模型回歸分析表明, 青魚幼魚獲得最高SGR時(shí)飼料中VE有效含量為45.0 mg/kg (圖1B)。

圖1 維生素E對(duì)青魚幼魚生長(zhǎng)的影響(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差, 重復(fù)數(shù)=3)Fig.1 Effects of dietary vitamin E levels on growth of juvenile Mylopharyngodon piceus (mean ± SD, n=3)

2.2 氨氮脅迫對(duì)青魚幼魚組織中維生素 E含量的影響

肌肉、肝臟和血清中VE含量均隨著飼料中VE含量的升高而呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05), 且當(dāng)飼料中VE含量達(dá)到或超過113.92 mg/kg時(shí), 肌肉和肝臟中VE含量均達(dá)到飽和狀態(tài)(圖2)。

氨氮脅迫使青魚肌肉和肝臟中VE有下降趨勢(shì),各處理組肌肉中 VE含量脅迫前后差異不顯著, 而肝臟中 VE含量在氨氮脅迫前后均差異顯著(P<0.05), 脅迫后, 210.45 mg/kg VE組肝臟VE含量仍顯著高于其他組(P<0.05)。氨氮脅迫前后對(duì)照組青魚血清VE含量無顯著變化, 但62.97和210.45 mg/kg VE組血清VE含量有升高趨勢(shì), 僅210.45 mg/kg VE組血清VE含量脅迫前后差異顯著, 且脅迫后62.97和210.45 mg/kg VE組血清VE含量仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 維生素E對(duì)氨氮脅迫前后組織維生素E含量的影響Fig.2 Effects of dietary vitamin E on tissue vitamin E contents of juvenile Mylopharyngodon piceus befor and after ammonia-nitrite stress

2.3 氨氮脅迫對(duì)部分血清生化指標(biāo)的影響

飼料VE對(duì)血清COR無顯著影響(圖3), 隨著飼料 VE含量的升高, 血清 MDA含量呈下降趨勢(shì)且210.45 mg/kg VE組MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。血清T-SOD和CAT活性隨著飼料VE含量升高呈上升趨勢(shì), 當(dāng)VE含量超過37.66 mg/kg時(shí), CAT活性顯著高于對(duì)照組, 而VE含量達(dá)到210.45 mg/kg時(shí), T-SOD活性才顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

氨氮脅迫使血清T-SOD和CAT活性降低, COR和MDA含量升高, 其中氨氮脅迫使對(duì)照組COR和MDA含量顯著升高(P<0.05)。但飼料中VE能有效降低脅迫后血清COR和MDA升高幅度, 62.97和210.45 mg/kg VE添加組氨氮脅迫前后COR含量差異不顯著, 且脅迫后210.45 mg/kg VE組COR含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05); 62.97和210.45 mg/kg VE組氨氮脅迫前后 MDA含量雖顯著升高, 但氨氮脅迫后, 210.45 mg/kg VE組MDA含量仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。氨氮脅迫對(duì)各處理組血清CAT活性無顯著影響, 卻顯著降低了對(duì)照組 T-SOD活性(P<0.05), 但62.97和210.45 mg/kg VE組T-SOD活性氨氮脅迫前后差異不顯著, 且氨氮脅迫后, T-SOD活性仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 氨氮脅迫對(duì)鰓絲NKA活性的影響

飼料中 VE對(duì)青魚鰓絲 NKA活性無顯著影響(圖4)。在氨氮脅迫后, 對(duì)照組和62.97 mg/kg VE組NKA活性均有所下降, 而210.45 mg/kg VE組NKA活性有所上升, 僅對(duì)照組鰓絲 NKA活性脅迫前后差異顯著(P<0.05), 且脅迫后210.45 mg/kg VE組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

飼料中 VE含量在一定范圍內(nèi)可明顯改善魚類的生長(zhǎng)性能, 缺乏或過量均會(huì)對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)[20—22]。本研究得到類似結(jié)果。通過折線模型分析得出, 青魚獲得最大特定生長(zhǎng)率時(shí)VE有效含量為45.0 mg/kg, 與許氏平(Sebasres schlegeli)(VE有效需求量45 mg/kg)[21]的VE有效需求量相似。但低于大西洋鮭(Salmo salar)(VE有效需求量60 mg/kg)[23]、花鱸(Lateolabrax japonicus)(VE有效需求量 60.5 mg/kg)[24]、斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus Rafinesque)(VE有效需求量100 IU/kg)[20]、鯉(Cyprinus carpio)(VE有效需求量 119 mg/kg)[22], 高于雜交條紋鱸(Morone saxatilis)(VE有效需求量28 mg/kg)[25]。不同魚類對(duì)VE的代謝率不同, 可能導(dǎo)致對(duì)VE需求存在差異, 此外, 還與飼料的組成、實(shí)驗(yàn)魚規(guī)格、投喂次數(shù)及水平、實(shí)驗(yàn)條件等多種因素有關(guān)。

圖3 維生素E對(duì)氨氮脅迫前后青魚幼魚血清生化指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of dietary vitamin E on serum biochemical indexs of juvenile Mylopharyngodon piceus before and after ammonia-nitrite stress

圖4 維生素E對(duì)氨氮脅迫前后青魚幼魚鰓絲NKA活性的影響Fig.4 Effect of dietary vitamin E on gill NKA activities of juvenile Mylopharyngodon piceus before and after ammonia-nitrite stress

組織中 VE含量與餌料中 VE的含量呈正相關(guān)性[24], 但隨攝入VE量的增加, 組織中VE的積累量將到達(dá)飽和[21,24]。在本實(shí)驗(yàn)中也存在同樣的趨勢(shì),隨著飼料中 VE含量的升高, 肌肉、肝臟和血清中VE含量呈顯著升高趨勢(shì), 當(dāng) VE含量超過 113.92 mg/kg時(shí), 肌肉和肝臟中VE含量變化趨于飽和。氨氮脅迫對(duì)肌肉 VE含量無顯著影響, 但使各組肝臟中 VE含量顯著降低, 且脅迫后 62.97和 210.45 mg/kg VE組血清VE含量均有不同程度的升高。有學(xué)者[25]認(rèn)為, 肝臟內(nèi)可能存在一個(gè)維生素E的“庫”,在調(diào)節(jié)外界環(huán)境應(yīng)激上存在相關(guān)性。當(dāng)魚體受到應(yīng)激后, 肝臟中儲(chǔ)存的維生素E可能被釋放至血液中,緩解機(jī)體因應(yīng)激所受氧化脅迫而導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)含量的下降。而氨氮脅迫使血液中VE含量升高, 可能跟脅迫后機(jī)體動(dòng)用肝臟中儲(chǔ)存的VE有關(guān)。然而, 中華鱉(Pelodiscus sinensis)[17]的研究發(fā)現(xiàn), 在酸應(yīng)激后, 中華鱉肝臟中VE并無顯著變化, 其原因可能與應(yīng)激的類型、強(qiáng)度和應(yīng)激時(shí)間的長(zhǎng)短等因素有關(guān)。

動(dòng)物體內(nèi)參與清除體內(nèi)過多自由基的防御系統(tǒng)包括非酶系統(tǒng)和酶系統(tǒng)。非酶系統(tǒng)主要包括 VE、VC、谷胱甘肽及微量元素等; 酶系統(tǒng)主要包括SOD(清除超氧陰離子)、CAT(清除過氧化氫)等。VE作為細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑, 可穩(wěn)定多不飽和脂肪酸及脂肪合成與分解的中間產(chǎn)物不被氧化破壞, 還可影響花生四烯酸的代謝和前列腺素的功能[26]。在甲殼類動(dòng)物如中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis Milne-Edwards)[26]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[27], 魚類如大菱鲆(Scophthalmus maximus)[28]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[29]等研究表明, VE可顯著提高機(jī)體抗氧化能力, 降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA產(chǎn)生[29,30]。本實(shí)驗(yàn)得到相似結(jié)果, 隨著飼料中 VE含量的增加, 青魚血清T-SOD和CAT活性呈升高趨勢(shì), 血清 MDA含量呈下降趨勢(shì)。在中華鱉[17]和建鯉(Cyprinus carpiovarJian)[18]的研究中, VE還能有效提高機(jī)體抵抗環(huán)境應(yīng)激的能力, 但暫無關(guān)于 VE增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物抗氨氮脅迫的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示, 氨氮脅迫雖對(duì)各處理組血清CAT活性無顯著影響, 但顯著降低了對(duì)照組血清 T-SOD活性, 而飼料中VE能有效緩解氨氮脅迫對(duì)血清T-SOD活性的影響。氨氮脅迫還顯著增加了各處理組青魚血清MDA含量, 但62.97和210.45 mg/kg VE組脅迫后MDA含量仍低于對(duì)照組。這表明, 飼料中VE可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力, 緩解因氧化脅迫導(dǎo)致丙二醛的產(chǎn)生, 從而能有效增強(qiáng)機(jī)體抗氨氮脅迫能力。

下丘腦?垂體?腎間組織軸是魚類應(yīng)激調(diào)節(jié)中樞,能釋放促腎上腺皮質(zhì)激素, 促進(jìn)頭腎細(xì)胞皮質(zhì)醇激素的合成與釋放, 而皮質(zhì)醇激素通常不被儲(chǔ)存, 直接進(jìn)入血液。因此, COR常作為衡量魚體應(yīng)激強(qiáng)度的指標(biāo)[13]。在魚類受到外界環(huán)境刺激后, 血液中COR明顯升高[19]。有研究結(jié)果表明, 動(dòng)物血液中COR與VE水平呈負(fù)相關(guān)[31]。但在本研究中, 各處理組血清中皮質(zhì)醇含量無顯著差異, 這與中華鱉[17]的研究結(jié)果相似。氨氮脅迫顯著增加了對(duì)照組青魚血清COR含量, 而飼料中VE可有效緩解氨氮脅迫造成的血清COR升高, 脅迫后210.45 mg/kg VE組COR顯著低于對(duì)照組。這說明 VE對(duì)應(yīng)激后 COR的升高有明顯抑制作用, 與 VE調(diào)節(jié)中華鱉[17]、金鯛(Sparus aurata)[31]等受環(huán)境脅迫后COR的研究結(jié)果相似。

鰓是魚類呼吸、氨氮排泄及滲透調(diào)節(jié)的主要部分, NKA是鰓組織泌氯細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上存在的一種蛋白酶, 在魚體滲透調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用。氨氮脅迫對(duì)青魚鰓絲NKA活性可產(chǎn)生顯著影響, 氨氮脅迫6h后, 青魚鰓滲透調(diào)節(jié)被有效激活,鰓絲NKA活性在6—48h呈上升趨勢(shì)[19]。目前, 有關(guān)VE對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物鰓絲NKA活性的影響無相關(guān)報(bào)道,但何敏[32]指出, VE可顯著提高斑點(diǎn)叉尾肝胰臟和腸道 NKA 活性, 此外, 在人[33]和大鼠[34]的研究中發(fā)現(xiàn), VE可提高應(yīng)激下紅細(xì)胞NKA活性。本研究顯示, VE對(duì)青魚鰓絲NKA活性雖無顯著影響, 但氨氮脅迫使對(duì)照組 NKA顯著降低, 而 62.97和210.45 mg/kg VE組 NKA卻無顯著差異且 210.45 mg/kg VE組脅迫后均顯著高于對(duì)照組。這說明VE在調(diào)節(jié)氨氮脅迫后鰓絲NKA活性起到一定促進(jìn)作用。

綜上所述, VE可促進(jìn)青魚生長(zhǎng), 其獲取最大生長(zhǎng)的有效VE需求為45.0 mg/kg。VE可提高機(jī)體血清抗氧化酶活性, 抑制MDA產(chǎn)生, 增加機(jī)體抗氧化能力, 還可緩解脅迫對(duì)機(jī)體的應(yīng)激強(qiáng)度、對(duì)抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)酶活性的影響, 從而提高機(jī)體抗環(huán)境脅迫能力。

致謝：

衷心感謝劉巧林、馬曉、金紅春、周偉、劉敏、姚一斌、王曉娜、高巍、金柏濤、何志剛等在實(shí)驗(yàn)樣品采集過程中提供熱心的幫助！

[1] Haywood G P.Ammonia toxicity in teleost fishes： a review[J].Canadian Technical Report of Fisheries and Aquatic Science, 1983, 1177： 1—35

[2] Handy R D, Poxton M G.Nitrogen pollution in mariculture：toxicity and excretion of nitrogenous compounds by marine fish [J].Reviews in Fish Biology and Fisheries, 1993, 3(3)：205—241

[3] Romano N, Zeng C S.Ontogenetic changes in tolerance to acute ammonia exposure and associated gill histological alterations during early juvenile development of the blue swimmer crab,Portunus pelagicus[J].Aquaculture, 2007,266(1—4)： 246—254

[4] Ching B, Chew S F, Wong W P,et al.Environmental ammonia exposure induces oxidative stress in gills and brain ofBoleophthalmus boddarti(mudskipper) [J].Aquatic Toxicology, 2009, 95(3)： 203—212

[5] Huang H Z, Li Y, Song X H,et al.4NH+-N stress on immune function ofEriocheir sinensis[J].Oceanalogia Et Limnologia Sinica, 2006, 37(3)： 198—205 [黃鶴忠, 李義,宋學(xué)宏, 等．氨氮脅迫對(duì)中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis)免疫功能的影響．海洋與湖沼, 2006, 37(3)： 198—205]

[6] Liu C H, Chen J C.Effect of ammonia on the immune response of white shrimpLitopenaeus vannameiand its susceptibility toVibrio alginolyticus[J].Fish and Shellfish Immunology, 2004, 16(3)： 321—334

[7] Jiang G J, Yu R C, Zhou M J.Modulatory effects of ammonia-N on the immune system ofPenaeus japonicusto virulence of white spot syndrome virus [J].Aquaculture, 2004,241(1—4)： 61—75

[8] Qiu D Q, Zhou X J, Qiu M S.Study on anti-disease ability ofLitopenaeus vannameiand the biological control ofVibrio parahaem olyticusbacteriophage under stresses of ammonia nitrogen [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(4)： 456—461 [邱德全, 周鮮嬌, 邱明生．氨氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦抗病力和副溶血弧菌噬菌體防病效果研究．水生生物學(xué)報(bào),2008, 32(4)： 456—461]

[9] Bucher F, Hofer R.The effects of treated domestic sewage on three organs (gills, kidney, liver) of brown trout (Salmo trutta) [J].Water Research, 1993, 27(2)： 255—261

[10] Zhou X, Dong Y W, Wang F,et al.The effect of high ammonia concentration on gill structure alternation and expression ofsodandhsp90 genes in grass carp,Ctenopharyngodon idella[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(2)： 321—328 [周鑫, 董云偉, 王芳, 等.急性氨氮脅迫對(duì)于草魚sod和hsp90基因表達(dá)及鰓部結(jié)構(gòu)的影響.水生生物學(xué)報(bào),2013, 37(2)： 321—328]

[11] Romano N, Zeng C S.Importance of balanced Na+/K+ratios for blue swimmer crab,Portunus pelagicus, to cope with elevated ammonia-N and differences betweenin vitroandin vivogill Na+/K+-ATPase responses [J].Aquaculture, 2011,318(1—2)： 154—161

[12] Mai K S, Ai Q H, Xu W,et al.Stress in Aquaculture and Its Prevention with Emphasis on Nutritional Methods [J].Periodical of Ocean University of China, 2004, 34(5)： 767—774[麥康森, 艾慶輝, 徐瑋, 等．水產(chǎn)養(yǎng)殖中的環(huán)境脅迫及其預(yù)防——營養(yǎng)學(xué)途徑．中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 34(5)：767—774]

[13] Wise D J, Tomasso J R, Schwedler T E,et al.Effect of vitamin E on the immune response ofChannel catfishtoEdwardsiella ictaluri[J].Journal of Aquatic Animal Health,1993, 5(3)： 183—188

[14] Montero D, Tort L, Robaina L,et al.Low vitamin E in diet reduces stress resistance of gilthead seabream (Sparus aurate)juveniles [J].Fish & Shellfish Immunology, 2001, 11(6)：473—490

[15] Carballo E C, Tuan P M, René J M,et al.Vitamin E(α-tocopherol) production by the marine microalgaeDunaliella tertiolectaand Tetraselm is suecica inBatch cultivation[J].Biomolecular Engineering, 2003, 20(4—6)： 139—147

[16] Gao M H.Effects of supplemental vitamin C and E in diet under nitrite stress on some blood biochemical indexes and antioxidant capability ofCarassius auratus gibelio[D].Wuhan： Huazhong Agricultural University Master’s Degree Dissertation.2008 [高明輝．VC、VE對(duì)亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽血液指標(biāo)及抗氧化能力的影響．武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文.2008]

[17] Zhou X Q, Xie M X, Niu C J,et al.Effects of the combination of vitamin C and E on growth, liver vitamin C and E,and levels of serum cortisol in stressed and non-stressed juvenile soft-shelled turtlesPelodiscus sinensis[J].Acta Zoologica Sinica, 2004, 50(2)： 158—164 [周顯青, 謝孟峽, 牛翠娟, 等．維生素C和E合用對(duì)應(yīng)激和非應(yīng)激中華鱉幼鱉生長(zhǎng)、肝臟維生素C和E以及血清皮質(zhì)醇含量的影響．動(dòng)物學(xué)報(bào), 2004, 50(2)： 158—164]

[18] Wang G Q, Niu X T, Lu H M,et al.Effect of dietary vitamin E and DHA Levels on growth and feed and differentiation ofCyprinus carpiovar.jianjuvenile in different stocking density [J].Journal of Jilin Agricultural University, 2010, 32(5)：548—554 [王桂芹, 牛小天, 盧洪梅, 等．飼料中添加VE和DHA對(duì)不同養(yǎng)殖密度建鯉生長(zhǎng)、攝食和分化的影響．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 32(5)： 548—554]

[19] Hu Y, Huang Y, Zhong L,et al.Effects of ammonia stress on the gill Na+/K+-ATPase, microstructure and some serum physiological-biochemical indices of juvenile black carp(Mylopharyngodon piceus) [J].Journal of Fisheries of China,2012, 36(4)： 538—545 [胡毅, 黃云, 鐘蕾, 等．氨氮脅迫對(duì)青魚幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶、組織結(jié)構(gòu)及血清部分生理生化指標(biāo)的影響．水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2012, 36(4)： 538—545]

[20] He M, Wang K Y, Zhang Y.Effect of vitamin E on SS expression in gastrointestinal tract of channel catfish,Ictalurus punctatus Rafinesque[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2010,34(1)： 220—224 [何敏, 汪開毓, 張宇.維生素E對(duì)斑點(diǎn)叉尾胃腸道生長(zhǎng)抑素表達(dá)的影響.水生生物學(xué)報(bào), 2010,34(1)： 220—224]

[21] Bai S, Lee K J.Different levels of dietary DL-α-tocopherol acetate affect the vitamin E status of juvenile Korean rockfish,Sebastes schlegeli[J].Aquaculture, 1998, 161： 405—414

[22] Watanabe T, Takeuchi T, Matsui M,et al.Effects of α-tocopherol deficiency on carp： Ⅶ The relationship between dietary levels of linoleate and α-tocopherol requirement [J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1977, 43(8)： 935—946

[23] Hamre k, Lie O.Minimum requirement of vitamin E for Atlantic salmon,Salmo salarL., at first feeding [J].Aquaculture Research, 1995, 26(3)： 175—184

[24] Zhou L B, Zhang W, Wang A L,et al.Effects of dietary vitamin E supplement on growth, tissue vitamin E concentration and immune responses of Japanese seabass (Lateolabrax japonicus) [J].Journal of Fisheries of China, 2009, 33(1)：95—102 [周立斌, 張偉, 王安利, 等．飼料維生素E添加量對(duì)花鱸生長(zhǎng)、組織中維生素E積累量和免疫指標(biāo)的影響.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2009, 33(1)： 95—102]

[25] Kocabas A M, Gatlin Ⅲ D M.Dietary vitamin E requirement of hybrid striped bass (Morone chrysopsfemale×M.saxatilismale) [J].Aquaculture Nutrition, 1999, 5(1)： 3—7

[26] Ai C X, Chen L Q, Liu X L,et al.Effect of dietary vitamin E on the Po, Uaand Ulactivities of chinese mitten-handed crab,Eriocheir sinensis[J].Ochenologia et Limnologia Sinica,2008, 39(2)： 119—123 [艾春香, 陳立僑, 劉曉玲, 等．維生素E對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)酚氧化酶、抗菌力和溶菌酶活性的影響．海洋與湖沼, 2008, 39(2)： 119—123]

[27] Hu J R, Wang A L, Cao J M.Effects of dietary vitamin e and selenium on the antioxidant system of shrimpLitopenaeus Vannamei[J].Ochenologia et Limnologia Sinica, 2010,41(1)： 68—74 [胡俊茹, 王安利, 曹俊明．維生素E和硒互作對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用．海洋與湖沼, 2010, 41(1)： 68—74]

[28] Wei Y T, Wang X J, Mai K S,et al.Effect of dietary vitamin E on growth, tissue lipid peroxidation, and tissue antioxidant capacity of juvenile turbot,Scophthalmus maximus[J].Pe-riodical of Ocean University of China, 2011, 41(6)： 45—50[魏玉婷, 王小潔, 麥康森, 等．飼料中的維生素E對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)、脂肪過氧化及抗氧化能力的影響．中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 41(6)： 45—50]

[29] Chen C, Xiong J, Zuo Y S,et al.Effects of vitamin E levels on growth performance and immune function of juvenilePelteobagrus fulvidraco[J].Journal of Fishery Sciences of China, 2010, 17(3)： 521—526 [陳騁, 熊晶, 左永松, 等．飼料中不同維生素 E添加量對(duì)黃顙魚幼魚生長(zhǎng)性能及免疫功能的影響．中國水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(3)： 521—526]

[30] Peng L I, Gatlin Ⅲ D M.Dietary vitamin E requirement of the red drumSciaenops ocellatus[J].Aquaculture Nutrition,2009, 15(3)： 313—319

[31] Montero D, Tort L, Robaina L,et al.Low vitamin E in diet reduces stress resistance of gilthead seabream (Sparus aurata)juveniles [J].Fish and Shellfish Immunology, 2001, 11(6)：473—490

[32] He M.Effects of vitamin E on growth performance, meat quality and immune responses in channel catfish, (Ictalurus punctatus Rafinesque) [D].Ya’an： Sichuan Agricultural University Doctor Degree Dissertation.2009 [何敏．維生素E對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)性能、免疫功能及肉質(zhì)影響的機(jī)理研究．雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文.2009]

[33] Wang F, Chen Y M, Dong Z S.Effect of dietary fat and vitamin E on the changes of erythrocytic menbrane Na,K-ATPase and LPO in the plasma of cold-exposed human [J].Acta Nutrimenta Sinica, 1996, (1)： 39—43 [王楓, 陳耀明,董兆申．高膳食和VE對(duì)冷暴露人紅細(xì)胞膜Na+, K+-ATP酶活性及血漿脂質(zhì)過氧化的影響．營養(yǎng)學(xué)報(bào), 1996, (1)：39—43]

[34] Wang F, Dong Z S.The effect of dietary Vitamin E on content of MDA and activity of (Na, K)-ATPase in RBC membrane of cold-stress rats [J].Chinese Journal of Public Health, 1998, 17(2)： 696—698 [王楓, 董兆申．VE對(duì)冷應(yīng)激大鼠紅細(xì)胞膜丙二醛含量和鈉, 鉀-ATP酶活性的影響．中國公共衛(wèi)生學(xué)報(bào), 1998, 17(2)： 696—698]