轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127品系成分LAMP快速檢測方法的建立

蔡穎，周廣彪，劉津，高東微，凌莉，劉靜宇，易敏英，吳少云，李志勇，*

（1.汕頭出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東汕頭， 515031；2.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623；3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641）

轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系是美國拜爾公司研發(fā)的抗草胺磷除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆品種，1998 年已獲美國官方批準(zhǔn)使用，并相繼在墨西哥、加拿大、日本、阿根廷、巴西等國家獲準(zhǔn)進行商業(yè)化種植或作為食品原料進口[1]。該品系在我國未批準(zhǔn)許可進口及使用，為非法轉(zhuǎn)基因大豆品系。

我國每年從國外進口大量的大豆，2011 年進口量達5 264 萬t，約占全球大豆進口量的60%[2]，其中絕大部分都是轉(zhuǎn)基因大豆。另外，由于大豆制品在食品中廣泛使用，進口食品中也可能含有轉(zhuǎn)基因大豆成分。為了保護我國大豆種質(zhì)資源安全，保護我國消費者的知情權(quán)，農(nóng)業(yè)部和國家質(zhì)檢總局分別頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》[3]和《進出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》[4]等法律法規(guī)，要求實行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識和進口審核制度。

《進出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》規(guī)定，為了防止含有非法轉(zhuǎn)基因大豆成分的產(chǎn)品進入我國，必須對進口大豆和相關(guān)食品進行轉(zhuǎn)基因檢測，保證其實際轉(zhuǎn)基因成份與批準(zhǔn)文件相符。目前，國內(nèi)對轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 及其衍生品種的檢測使用農(nóng)業(yè)部1485 號公告-8-2010《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆A5547-127 及其衍生品種定性PCR 方法》[5]，采用的是普通PCR 方法。普通PCR 方法檢測操作繁瑣，靈敏度比較低，容易造成交叉污染和結(jié)果出現(xiàn)假陽性、假陰性的比例偏高。如果參照歐盟的方法[6]采用熒光PCR 方法，由于成本昂貴、技術(shù)要求高，需要大型的儀器設(shè)備，并不適合于基層實驗室的日常檢測。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法[7]（LAMP，Loop-mediated Isothermal Amplification）是Notomi T 等在PCR 基礎(chǔ)上發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，由于不需要昂貴的大型儀器，不需要熒光標(biāo)記，可快速、高效擴增目標(biāo)片段，靈敏度高，操作簡便快速、結(jié)果判讀簡便等優(yōu)點，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域的檢測，如病毒、細菌、真菌和寄生蟲等[8-12]。

本研究旨在建立轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系成分的LAMP 快速檢測方法，并對方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性進行測試。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品

轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品：A5547-127（100%）、DP356043（10%）、DP305423（10%）、GTS40-3-2（10%）、MON89788（100%）；轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品：GA21（100%）、MON810（10 %）、MON89034（100 %）、98140（10 %）、MIR604（100%）、Bt-176（5%）；轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)準(zhǔn)品：KMD（100%）、Bt63（5%），分別購自于AOCS、IRMM 和ERM。

1.1.2 樣品

包括非轉(zhuǎn)基因大豆（5 份）、非目的轉(zhuǎn)基因大豆制品（5 份）、其他轉(zhuǎn)基因植物樣品（5 份）、其他植物加工產(chǎn)品（5 份）均來自于進口商品。

1.1.3 模擬樣品DNA

由于未獲得含A5547-127 成分的大豆樣品及豆制品，本試驗使用由A5547-127 標(biāo)準(zhǔn)品提取的DNA與陰性大豆樣品、豆制品提取的DNA 進行混配，制成3 類模擬樣品DNA：第一類，將陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA 與一份陰性大豆DNA 按不同比例進行混合，制成人工混配的系列濃度模擬陽性樣品；第二類，將陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA 與多份陰性大豆DNA 分別進行混合，制成陽性模擬大豆樣品；第三類，將陽性標(biāo)準(zhǔn)品DNA 與多份陰性豆制品DNA 分別進行混合，制成含陽性模擬大豆制品。

1.1.4 試劑

CTAB、Tris、EDTA 等：北京鼎國生物技術(shù)有限公司；Ex Taq：寶生物工程（大連）有限公司；甜菜堿、Bst DNA聚合酶：Sigma 公司；SYBR GreenⅠ：廈門百維信生物科技公司。

1.1.5 儀器

LA-320C LAMP 檢測實時濁度儀：日本榮研化學(xué)株式會社。

1.2 DNA 的提取

按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19495.7-2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測抽樣和制樣方法》[13]制備樣品，按GB/T 19495.3-2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法》[14]提取樣品DNA（采用CTAB 法）。

1.3 引物設(shè)計、合成和篩選優(yōu)化

根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系特異靶序列，采用LAMP 專用引物設(shè)計軟件在線設(shè)計軟件Primer Explorer Version 3 設(shè)計3 套LAMP 引物。使用含量為100%的A5547-127 標(biāo)準(zhǔn)品進行引物篩選比較試驗，最終確定一套最佳特異性引物。

1.4 LAMP 方法的建立

初步確定25 μL 的LAMP 反應(yīng)體系，其成分包括：1×ThermoPol 緩沖液、外引物F3 和B3 各0.2 μmol/L、內(nèi)引物FIP 和BIP 各1.6 μmol/L、環(huán)狀上游引物L(fēng)B 0.8 μmol/L、1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mol/L 甜菜堿、6 mmol/L硫酸鎂、0.32 U/μL Bst DNA 聚合酶、DNA 模板200 ng。參照LAMP 濁度儀使用說明書，將混合物置于反應(yīng)孔中，在反應(yīng)管中加入1 滴石蠟油，管蓋內(nèi)壁加入1 μL 0.1%的SYBR GreenⅠ。然后將其置于65 ℃恒溫反應(yīng)90 min，最后80 ℃滅活5 min 結(jié)束反應(yīng)。濁度儀實時觀察反應(yīng)管中是否發(fā)生擴增，如果發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，濁度增加，濁度儀上會出現(xiàn)相應(yīng)的峰段。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管蓋內(nèi)壁的SYBR GreenⅠ離心，觀察反應(yīng)管中液體顏色，進一步驗證是否發(fā)生擴增反應(yīng)，如發(fā)生擴增，溶液為綠色，否則保持SYBR GreenⅠ橙色不變。

1.5 LAMP 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

使用篩選出的最佳特異性引物，選取Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs 濃度和反應(yīng)溫度4 個變量參數(shù)，進行單因素變化實驗，對LAMP 反應(yīng)條件進行優(yōu)化。

1）Mg2+濃度優(yōu)化：設(shè)置4 個Mg2+濃度梯度依次為4、6、8、10 mmol/L；

2）甜菜堿濃度優(yōu)化：設(shè)置4 個甜菜堿濃度梯度依次為0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L；

3）dNTPs 濃度優(yōu)化：設(shè)置4 個dNTPs 濃度梯度依次為1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；

4）反應(yīng)溫度優(yōu)化：設(shè)置4 個反應(yīng)溫度梯度依次為61、63、65、67 ℃。

根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.6 對所建立的LAMP 方法的評價

按照優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進行標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、模擬樣品等的LAMP 擴增反應(yīng)，對所建立的LAMP方法進行靈敏度（檢測低限）、特異性和穩(wěn)定性評價，同時與歐盟官方方法實時熒光PCR 方法[6]的檢測結(jié)果進行比較。

1.7 樣品及模擬樣品檢測

利用建立的LAMP 方法對共計20 份陰性樣品（見1.1.2）、5 份陽性模擬大豆樣品和5 份陽性模擬大豆制品（見1.1.3）進行檢測，同時與實時熒光PCR 方法的檢測結(jié)果進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選與優(yōu)化

引物篩選比較試驗顯示：第1 套引物沒有發(fā)生擴增反應(yīng)；第2 套引物出現(xiàn)了假陽性，而且出峰時間50 min 左右，比較晚；第3 套引物發(fā)生了擴增反應(yīng)，出峰時間為34 min 左右，峰高為0.15，出峰時間和峰高值都適中，而且峰也較光滑。綜上所述，初步選定第3 套引物：

外引物擴增片段長度：208 bp

2.2 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

選取Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs 濃度和反應(yīng)溫度4 個變量參數(shù)，使用第三套引物進行單因素變化實驗，采用濁度儀中該反應(yīng)曲線的出峰時間和出峰高度作為評價的指標(biāo)，選擇最佳的反應(yīng)參數(shù)。實驗結(jié)果表明：在25 μL 反應(yīng)體系中，當(dāng)MgSO4濃度為6 mmol/L，甜菜堿濃度：0.8 mol/L，dNTPs 濃度：1.4 mmol/L 時，在63 ℃恒溫反應(yīng)90 min，然后在80 ℃滅活5 min 結(jié)束反應(yīng)，轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系的特異性擴增效果最好。

2.3 特異性試驗

為驗證LAMP 方法的特異性，使用優(yōu)化后的LAMP 方法檢測13 份不同品系的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻標(biāo)準(zhǔn)品（見1.1.1）。實驗結(jié)果顯示，僅轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系有峰值出現(xiàn)，且SYBR Green I 顯色為綠色，在其他轉(zhuǎn)基因大豆品系中均未得到任何擴增產(chǎn)物。說明本研究建立的LAMP 方法對轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系具有嚴格的特異性。

2.4 靈敏度實驗

LAMP 顯色法結(jié)果顯示抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 的10%模擬樣品、1 %模擬樣品、0.5 %模擬樣品、0.1%模擬樣品，空白樣品（0%）的陰陽性結(jié)果均正確，準(zhǔn)確率達到100%，與實時熒光PCR 方法的檢測結(jié)果一致（圖1、圖2）。從LAMP 顯色結(jié)果可看出轉(zhuǎn)基因含量越高，顏色變化越明顯（圖3）。LAMP 實時20 份陰性樣品、10 份陽性模擬樣品的LAMP 反應(yīng)結(jié)果全部正確，準(zhǔn)確率達到100%，與熒光PCR 反應(yīng)的檢出結(jié)果一致（見表1），說明用LAMP 方法檢測各類樣品和制品的轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系成分方法特異性良好。濁度法的檢測結(jié)果圖也顯示轉(zhuǎn)基因含量越高，開始出現(xiàn)大量擴增的時間越短。靈敏度實驗表明，LAMP 顯色法、實時濁度法的檢測低限均至少可達0.1%。

圖1 靈敏度實驗的LAMP 實時濁度法檢測結(jié)果Fig.1 Results of sensitivity test by LAMP real-time turbidity method

表1 特異性試驗檢測結(jié)果Table 1 Results of specificity test

圖2 靈敏度實驗的實時熒光PCR 法檢測結(jié)果Fig.2 Results of sensitivity test by real-time fluorescent PCR method

圖3 靈敏度實驗的LAMP 顯色法檢測結(jié)果Fig.3 Results of sensitivity test by LAMP coloration method

由左至右分別為轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系10 %模擬樣品、1%模擬樣品、0.5%模擬樣品、0.1%模擬樣品和0%空白樣品的熒光PCR 擴增曲線。

2.5 穩(wěn)定性實驗

為評估LAMP 方法的穩(wěn)定性，用本研究建立的LAMP 顯色法、LAMP 實時濁度法分別對4 個不同濃度（0%、1%、5%、10%）的模擬樣品進行檢測，每個模擬樣品重復(fù)20 次，同時與實時熒光PCR 方法進行比對。結(jié)果顯示，各種試驗濃度的模擬樣品的LAMP 顯色法、LAMP 實時濁度法檢測結(jié)果均合格，準(zhǔn)確率達到100 %，和實時熒光PCR 方法的結(jié)果一致。說明用LAMP 方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系成分穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品及模擬樣品檢測

LAMP 顯色法與LAMP 實時濁度法的結(jié)果顯示，

3 結(jié)論

本文建立轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系特異性的LAMP 快速檢測方法，該方法適用于大豆及其制品中轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 品系成分特異性檢測，靈敏度達到0.1%，具有良好的穩(wěn)定性和高度的特異性，用于實際陰性樣品和陽性模擬樣品檢測時與實時熒光PCR 方法相比檢測結(jié)果一致，假陰性率和假陽性率均為0%。

LAMP 實時濁度法采用濁度儀判讀結(jié)果，解決了傳統(tǒng)LAMP 法無法實時監(jiān)控實驗反應(yīng)的問題，還可根據(jù)出峰時間，峰值高低以及峰型的光滑程度對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化，極大縮短了優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)的過程。而LAMP 顯色法不需要另外購置設(shè)備，僅憑肉眼根據(jù)顏色便可準(zhǔn)確判斷結(jié)果，大大降低了實驗成本，而且對實驗人員的技術(shù)要求不高，滿足了基層實驗室的檢測業(yè)務(wù)需求要求，是適合大宗糧谷現(xiàn)場檢驗或基層實驗室推廣使用的一種快速檢測方法。

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