花生仁脂肪酸GC-MS指紋圖譜研究

李京華，李國琛，王曉鈺，王念虎，王顏紅，趙春杰，*

（1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016）

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在我國遼寧、江西、福建等十幾個省份廣泛種植，種植面積達(dá)467 萬hm2[1]。研究證實(shí)我國不同產(chǎn)地的花生品質(zhì)差異大[2-3]?；ㄉ手泻孔罡叩臓I養(yǎng)成分是脂肪，其含量達(dá)50%[4]。脂肪酸是花生仁脂肪的主要成分，包括飽和、不飽和以及特殊脂肪酸。不飽和脂肪酸具有抗氧化、抗自由基、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降低高密度脂蛋白血清膽固醇的作用，進(jìn)而減少高血壓、心臟病及中風(fēng)等疾病的發(fā)病率[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)花生油含不飽和脂肪酸80%以上（其中含油酸41.2%，亞油酸37.6%），另外還含有軟脂酸，硬脂酸和花生酸等飽和脂肪酸19.9%[6-7]。已有文獻(xiàn)研究主要集中在花生仁脂肪酸組成成分的鑒定及相對含量的測定[8-11]。目前關(guān)于花生仁脂肪酸指紋圖譜的文獻(xiàn)報道較少[12-13]。研究初步證實(shí)，依據(jù)花生仁脂肪酸圖譜可以鑒別不同產(chǎn)地的花生[14]，但對于同一花生品種在不同地理分布區(qū)脂肪酸的差異性研究較少。本研究以江西、福建、湖北、黑龍江4 個省份的同一品種的花生仁樣品為研究對象，建立了其脂肪酸氣相色譜指紋圖譜，明確了花生仁脂肪酸成分，并結(jié)合主成分分析建立模型對花生樣品進(jìn)行了分類，為花生的質(zhì)量品質(zhì)評價和產(chǎn)地溯源研究提供了一定參考依據(jù)。

1 儀器與材料

STCS/GL-ZD-340 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：中國Thermo Fisher 公司；20PR-52D 自動高速冷凍離心機(jī)：日本Hitachi 公司；BS110 型電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

石油醚、甲醇、氫氧化鈉均為分析純：山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；去離子水：中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所實(shí)驗(yàn)室自制?；ㄉ蕵悠酚烧n題組自采，采制日期為2012 年10 月份，樣品編號及來源見表1。

表1 花生仁樣品來源Table 1 Origin of peanut seeds

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

不同產(chǎn)地的花生樣品置通風(fēng)陰涼處自然風(fēng)干，粉碎后過200 目篩。稱取3 份，每份約50 mg，精密稱定置于10 mL 帶刻度離心管中，加入石油醚2 mL，振蕩5 min。向提取液中加入0.5 mol/L 甲醇鈉2 mL，振蕩10 min 進(jìn)行甲酯化，加入去離子水2 mL，于高速冷凍離心機(jī)離心10 min（4 ℃10 000 r/min），吸取上清液進(jìn)行GC-MS 分析。

2.2 GC-MS 分析條件

色譜條件：色譜柱為DB-1 石英毛細(xì)管柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m）；載氣為氦氣；升溫程序：初溫140 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升至190 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min 升至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min 升至260 ℃，保持10 min 進(jìn)樣口溫度280 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比20 ∶1；流速1.0 mL/min；溶劑延遲5 min。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度250 ℃；發(fā)射電流50 μA；氣相色譜質(zhì)譜接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～500。

2.3 脂肪酸組分的確定

[7]和NIST 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，鑒定色譜圖中各峰。共鑒別出16 種脂肪酸成分，GC-MS 總離子流色譜圖如圖1 所示。

2.4 方法學(xué)考察及樣品測定

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取同一批花生樣品供試品溶液（FJ13），同一色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄指紋圖譜信息，計(jì)算各主要色譜峰的保留時間和其峰面積的RSD 值。結(jié)果保留時間的RSD＜0.13%，色譜峰面積的RSD＜5.0%，說明儀器的精密度良好。

圖1 花生仁脂肪酸總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of fatty acids from peanut seed

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次樣品供試品溶液（FJ13），按供試品溶液的制備方法分別制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣并記錄指紋圖譜信息。計(jì)算得出譜圖中各主要色譜峰保留時間的RSD＜0.14%，峰面積的RSD＜5.0%。說明該方法的重復(fù)性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試樣品（FJ13），分別于0、2、4、16、24、48 h 檢測供試品的指紋圖譜，計(jì)算各主要色譜峰保留時間和峰面積，結(jié)果得保留時間的RSD＜0.18%，峰面積的RSD＜5.0%，表明樣品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 樣品色譜指紋圖譜

不同批次的樣品按2.1 項(xiàng)供試品溶液制備方法以及2.2 項(xiàng)下測定分析條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄指紋圖譜16個主要脂肪酸色譜峰，計(jì)算得共有峰面積占總峰面積95%以上，采用面積歸一化法計(jì)算各主要色譜峰的相對峰面積。

2.5 相似度分析

相似度可以定量描述指紋圖譜，本研究采用相似度計(jì)算方法對樣品進(jìn)行比較，定量、客觀地對樣品進(jìn)行評價。本研究以55 批樣品譜峰面積均值建立花生脂肪酸的氣相色譜指紋圖譜共有模式，然后采用夾角余弦、相關(guān)系數(shù)為測度[15]計(jì)算樣品與共有模式之間的相似度。

2.6 主成分分析

本研究借助SIMCA-P11.5 軟件對不同批次的樣品進(jìn)行PCA 分析，主成分分析提取了兩個主成分，評價主成分提取的兩個參數(shù)是R2X（cum）和Q2（cum），R2X 和Q2 的數(shù)值分別為88.7%和75.6%，說明主成分信息提取較完全。PCA 分析載荷圖如圖2 所示。

圖2 PCA 分析載荷圖Fig.2 PCA loading plots

載荷圖反映了16 個脂肪酸組分變量對花生樣本主成分得分值的貢獻(xiàn)大小，載荷值越大，表明該變量對該主成分的貢獻(xiàn)率越高。結(jié)合得分圖中組間分布差異，可找出對這種差異貢獻(xiàn)較大的變量。觀察其主成分的載荷圖，發(fā)現(xiàn)其脂肪酸成分均距原點(diǎn)較遠(yuǎn)，說明這些共有譜峰對花生脂肪酸組成差異均有較大貢獻(xiàn)。以PCA 得分圖為基礎(chǔ)進(jìn)行不同樣品的脂肪酸分析，每個點(diǎn)分別代表一個樣品，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離代表各個樣品之間存在的特征差異程度[16]。PCA 得分圖如圖3所示。

圖3 PCA 得分圖Fig.3 PCA score

3 討論

3.1 指紋圖譜分析

由花生脂肪酸總離子流色譜圖可以看出各主要色譜峰的保留時間、峰面積及各峰之間的相對比例是評價指紋圖譜的重要指標(biāo)參數(shù)。從譜峰相對保留時間看，55 批花生樣品氣相色譜指紋圖譜相似性較高，說明建立的指紋圖譜準(zhǔn)確可靠。計(jì)算譜圖中的16 個主要脂肪酸色譜峰得不飽和脂肪酸油酸、亞油酸含量最高，其峰面積占共有總峰面積的61.7%～70.2%，其次是軟脂酸、硬脂酸、花生酸等。不飽和脂肪酸含量的高低可以為花生仁脂質(zhì)質(zhì)量的評價提供一定的參考依據(jù)。

3.2 指紋圖譜的建立

由于花生中的脂肪酸成分主要是油酸和亞油酸，因此兩者對指紋圖譜有比較高的的貢獻(xiàn)率，其峰面積與比值對指紋圖譜的分析結(jié)果影響較大。不同產(chǎn)地的樣品存在差異，結(jié)果圖譜特征峰的相對含量即存在一定差異，在進(jìn)行相似度分析時不同批次的樣品結(jié)果即表現(xiàn)出了一定的差異。借助夾角余弦和相關(guān)系數(shù)值比較4 個省份指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示江西、福建、黑龍江3 省樣品相關(guān)系數(shù)值在0.94～1.00 之間，夾角余弦值在0.95～1.00 之間，表明此3 省的花生脂肪酸和共有模式的有較高的相似性，3 省花生脂肪酸差異較小。而黑龍江省相關(guān)系數(shù)值在0.80～0.87 之間，夾角余弦值在0.81～0.85 之間，由此可以看出黑龍江花生脂肪酸和共有模式的相似性較低，并和其它3 省存在較大的差異。

本文在建立GC 指紋圖譜時發(fā)現(xiàn)指紋信息量大，主要是指色譜峰的數(shù)目多且各峰面積的變化大，但試驗(yàn)的重復(fù)性相對較差，尤其是不同批次的樣品更難于重復(fù)測定，因此本實(shí)驗(yàn)將花生仁石油醚提取物甲酯化后，主要檢測花生仁中的脂肪酸類成分。這樣不僅簡化了GC 指紋圖譜的信息量，提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，并且明顯的突出了各脂肪酸成分含量的變化特征，以此為基礎(chǔ)建立了花生仁脂肪酸GC 指紋圖譜。

3.3 主成分分析結(jié)果

PCA 得分圖顯示4 個省份的花生樣品能實(shí)現(xiàn)基本分離：如圖3 所示55 批樣品聚集為兩大類，江西、福建、湖北3 省地區(qū)和黑龍江省樣品分布區(qū)域存在明顯差別，江西、福建、湖北樣品集中分布在一起，黑龍江與其它3 省樣品分散，距離較遠(yuǎn)，表明黑龍江和其它3 省花生仁脂肪酸存在較大的差異；江西、福建、湖北3 省樣品部分存在交叉分布，導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是3省地域接壤，地域相近地區(qū)的花生生長環(huán)境差別小，導(dǎo)致脂肪酸差異較小所造成的，但圖中仍可顯示出3省樣品各自聚集分布區(qū)域，各省個別樣品分布較為分散的原因尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。由此可以看出借助花生脂肪酸含量的差異，PCA 分析可以基本實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地的花生樣品分類。

4 結(jié)論

指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以為花生的鑒別研究提供有效的方法。通過GC-MS 建立了花生仁脂肪酸的指紋圖譜，利用不同產(chǎn)地的花生脂肪酸差異性進(jìn)行主成分分析。研究結(jié)果表明，根據(jù)花生仁脂肪酸的差異建立的主成分分析模型可以實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地花生樣品的分類，并可以為花生產(chǎn)地溯源研究提供一定的依據(jù)，同時可以表明地理分布因素可以對同一品種的花生產(chǎn)生不同的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]殷冬梅,張幸果,王允,等.花生主要品質(zhì)性狀的主成分分析與綜合評價[J].植物遺傳資源學(xué)報,2011,12(4)：507-512,518

[2]郭際華.不同栽培環(huán)境不同品種花生品質(zhì)的差異及改良潛力研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文.(2008-06-12)[2009-02-12].http：//www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx

[3]王才斌,劉云峰,吳正鋒,等.山東省不同生態(tài)區(qū)花生品質(zhì)差異及穩(wěn)定性研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,16(5)：1138-1142

[4]張忠信,朱松,劉莉娜,等.花生的營養(yǎng)成分與食療方劑[J].中國食物與營養(yǎng),2007(11)：57-58

[5]胡銳,李寶莉.多不飽和脂肪酸對心血管系統(tǒng)的作用及機(jī)制[J].西北藥學(xué)雜志,2008,23(2)：118-120

[6]騰葳,柳琪,郭棟梁.花生主要營養(yǎng)物質(zhì)含量的統(tǒng)計(jì)與分類分析[J].食品研究與開發(fā),2003,24(3)：84-85

[7]顧黎.花生油中脂肪酸組成的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J].林區(qū)教學(xué),2007(2)：124-125

[8]侯冬巖,回瑞華,李鐵純,等.黑花生和白花生中脂肪酸成分的比較[J].食品科學(xué),2011,32(2)：177-179

[9]王瑞,孫長霞,張澤生.幾種堅(jiān)果植物中脂肪酸含量的分析研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2007,14(4)：39-41

[10]高慧敏,張穎君.花生種子脂肪酸含量的微量、快速測定[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2010,26(13)：98-103

[11]禹山林,朱雨杰,閔平,等.傅立葉近紅外漫反射非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量[J].花生學(xué)報,2010,39(1)：11-14

[12]李曉丹,曹應(yīng)龍,胡亞平,等.花生種子發(fā)育過程中脂肪酸累積模式研究[J].中國油料作物學(xué)報,2009,31(2)：157-162

[13]SHIN EUI-CHEOL,RONALD B PEGG,PHILLIPS R DIXON,et al.Commercial Runner peanut cultivars in the USA：Fatty acid composition[J].Eur J Lipid Sci Technol,2010,112：195-207

[14]SHIN EUI-CHEOL,BRIAN D CRAFT,RONALD B PEGG,et al.Chemometric approach to fatty acid profiles in Runner-type peanut cultivars by principal component analysis(PCA)[J].Food chemistry,2010(119)：1262-1270

[15]王璽,王文宇,張克榮,等.中藥HPLC 指紋圖譜相似性研究的探討[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2003,20(5)：360-362

[16]杜強(qiáng),賈艷麗.SPSS 統(tǒng)計(jì)分析從入門到精通[M].北京：人民郵電出版社,2009：115-130